快速制备酵母DNA法

实验概要

本实验制备了酵母转化质粒，快速从转化酵母菌中分离了用于Southern分析的基因组DNA。

主要试剂

2％ Triton X－100，1％SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8)，1mmol/L Na₂EDTA，苯酚：氯仿：已戊醇（25：24：1），YPD培养基，TE缓冲液（pH8），RNase A，无水乙醇，4mol/L醋酸铵

主要设备

1.5ml微型离心管，培养皿，离心机，玻珠，振荡器

实验步骤

1. 酵母转化质粒的制备

   1) 在质粒DNA选择性培养基中，置30℃培养少量培养物过夜。

   2) 将培养物转入一支1.5ml的微型离心管，离心5秒，收集细胞。

   3) 小心倾去上清液，轻弹离心管，使沉淀重新悬浮于残余培养液中。

   4) 加入0.2ml的2％ Triton X－100，1％SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8)，1mmol/L Na₂EDTA；加入0.2ml的苯酚：氯仿：已戊醇（25：24：1）；加入0.3g酸洗过的玻珠。

   5) 振荡2分钟。

   6) 离心5分钟。

   7) 用1～5μl含DNA的水相转化0.2ml的大肠杆菌受体菌，用15μl水相转化酵母菌。

2. 用于Southern分析的基因组DNA分离

   1) 用YPD培养基，置30℃培养10ml酵母至最大生长量。

   2) 用医用离心机离心2分钟，弃上清液，收集细胞，用0.5ml蒸馏水重新悬浮，将细胞转入1.5ml微型离心管中，离心5秒收集细胞。

   3) 重复第二步。

   4) 重复第二步。

   5) 加0.2ml TE缓冲液（pH8），振荡3～4分钟。

   6) 离心5分钟，将水相移至洁净试管，加1ml的无水乙醇，上下倒置，混合均匀。

   7) 离心2分钟，弃上清液，悬浮在0.4ml TE缓冲液和3μl的10mg/ml的RNase A溶液，置37℃保温5分钟，加入10μl 4mol/L醋酸铵和1ml的无水乙醇，上下倒置，混匀。

   8) 离心2分钟，弃上清液，自然干燥后，用50μl的TE缓冲液悬浮，每份样品用10μl进行Southern印迹分析，每份用量约2～4μg DNA。

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