数字PCR—外泌体相关肿瘤分子标志物筛查

近几年外泌体研究的热度以及文章数量一直居高不下。人体几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，它是一种直径为 30～150 nm 的小囊泡，外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带多种蛋白质、RNA成分（编码RNA、非编码RNA）和脂类物质等。外泌体作为重要的传递信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，参与免疫应答、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭、促血管新生等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。

目前，越来越多的研究人员将外泌体与转化医学联系起来，特别是在液体活检方面，外泌体的研究将会为疾病的诊断与治疗带来重大改变。

由于外泌体的来源、结构和内含物等特性，研究人员可以从体液中获取外泌体作为早期疾病诊断的依据以及评估药物治疗效果。外泌体用于液体活检具有很大优势，一方面，外泌体比CTC或循环cfDNA能更早诊断出癌症，CTC和cfDNA只有在癌症发展到一定程度后才增多。另一方面，外泌体检测还避免了传统组织活检对患者造成的不适及损伤。此外，几乎所有体液均可作为活检的生物材料，因此能够保证外泌体来源。针对各种疾病的早期诊断方法将也有望投入实际应用。

 
在一些分析中，研究人员发现，检测体液中的外泌体，能鉴别出实体瘤特异的蛋白靶点，血清中的外泌体也带有胶质母细胞瘤相关的miRNA和mRNA突变。此外，通过分析外泌体miRNA，研究人员找到了肝癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌等等一系列疾病的标志物，如下图所示。
 

外泌体miRNA-1247-3p促进肝癌肺转移

（Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer www. Nature communications）。

肺癌相关外泌体miRNA参与癌症期间免疫系统的调控（The Potential Biomarkers and Immunological Effects of Tumor-Derived Exosomes in Lung Cancer. Front. Immunol.）

在外泌体中寻找肿瘤分子标志物，通常的研究思路如下：
 

在对筛选得到的差异分子进行再次验证时，数字PCR凭借其一系列优势获得了广泛的认可。

数字PCR可以提供比qPCR更精准的核酸定量，直接读取阳性信号，通过泊松分布校正得到目标基因的绝对拷贝数。并具有检测周期短，灵敏度和精确度高等特点。该技术是目前最适合用于体液样品（如血液、尿液、粪便、痰液、胸腹水、脑脊液等）中痕量核酸标记物检测的方法，数字PCR能够有效对二代测序等实验结果进行验证。