数字PCR应用（三）

Fluidigm公司于2006年底推出了基于集成流体通路（IFC）芯片的Bio-Mark™ 高通量基因剖析系统。

其创新在于集成液体通路技术：应用集成电路制造工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，经过不同的控制阀门控制溶液在其中的活动来完成生物样品的分液、混合、PCR扩增。

图8. Bio -Mark™ IFC芯片

六．dPCR的应用前景

6.1 痕量核酸检测

图 9. 痕量核酸检测的具体分类

dPCR尤其适合：对灵敏度要求非常高的核酸痕量分析研究；基质复杂样品中的核酸准确定量（如组织、体液、排泄物等样品）。

图10. 痕量核酸检测相关方法比较

6.1.1 癌症标志物稀有突变检测

在一份给定的样本中，相比于野生型DNA，癌症相关的突变序列比例较低，经常无法检测。而凭借其超高灵敏度，dPCR系统可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突变频率。之前用任何方法都无法实现准确稳定检测的样本，现在可以使用dPCR轻松进行定量分析。

是否能够开发出有效的靶向治疗药物，与突变基因的检测密切相关。其中（1）携带药物作用突变位点的癌细胞百分比；（2）突变的特定等位基因是否可以被准确检测到，这两点都直接影响到靶向治疗是否有效。很显然，在肿瘤均质细胞内检测单一突变相对简单，但是如果在异质组织内，在仅存有少量突变存在的情况下，如何准确检测出突变/稀有变异，或者针对于同一种癌症中多种亚克隆的准确鉴定，对个性化医疗的发展是一个巨大的挑战。

案列1. 实现肺癌相关的表皮生长因子受体（EGFR）中T790M突变的检测，可以更好地评估抗酪氨酸激酶抑制剂的治疗。然而，由于其他技术检测灵敏度有限，无法在高背景EGFR野生型中可靠地检测到T790M突变。研究人员使用dPCR技术开发出精确度很高的检测方法，以准确定量T790M的浓度[1]。

图11. ddPCR可以用EGFR突变的肺癌患者的血浆中游离DNA（cfDNA）为样本，检测与EGFR敏感性和药物抗性相关的突变

6.1.2 致病微生物检测

精确的病毒载量分析对于阐释疾病病程，后续治疗及疗效评估是至关重要的。病毒载量的波动，即使只下降了非常低的水平，意义却是显著的。在对病原体的研究中，能否实现准确而可靠的病毒DNA或RNA定量分析，关系到实验的成败。

案列2. 研究人员比较了 qPCR 和 dPCR 方法检测临床样本中残留的人类免疫缺陷病毒（HIV），其中包括功能性治愈的HIV感染婴儿。研究人员发现，在检测百万个细胞内的 HIV DNA拷贝数时，相比于 qPCR，dPCR 的灵敏度提升了5倍；在检测病毒长末端重复序列时，dPCR比qPCR灵敏提升了20倍[2]。

案列3. 研究人员探索HBV血清学和ddPCR检测结果与肝细胞癌（HCC）临床分期和病症之间的关系中，ddPCR成功的克服了real-time PCR（qPCR）在检测FFPE处理的肝癌患者组织样品中HBV DNA时，遇到的准确度、灵敏度和重复性不足的缺点。进而得出以下结论： 1、ddPCR的灵敏度和准确度比real-time PCR更高——131个待测样品中HBV DNA浓度范围为1.1~175.5 copies/ul； 2、即使是在24个血清学检测呈阴性的样本中也检测到了痕量的HBV DNA； 3、样品中HBV DNA的含量与肝细胞癌（HCC）组织的临床分期一致； 4、ddPCR技术可以用于肝癌的早期无创诊断，病程监控，肝移植、化疗或免疫抑制的疗效评估[3]。

6.2 与新一代测序（NGS）的无缝对接

相对于NGS， dPCR可以富集待测序样品中的靶基因; dPCR还可以验证 / 精确定量测序结果。

图12. ddPCR和NGS的优势互补

案列4. 由于人间充质干细胞（MSC）在人体内的含量极低，所以目前应用于临床治疗的MSCs都来源于体外培养。研究人员分别对体外培养p1，p8和p13阶段（passage）的来源于人骨髓MSC采用全基因组测序(WGS)。WGS结果显示在p1和p8阶段的培养细胞中没有拷贝数变异（CNV）和非常低频的单核苷酸突变(SNV)，但是p13阶段的SNCs数目显著增加，达到677个。采用ddPCR对WGS发现的8个非同义突变进行了确认，结果发现在未经培养的单核细胞内就含有极低频对应的突变(0.01%)，在p1和p8阶段培养的MSC内其突变比例依然处于极低比例状态(0.1-1%)，但是在p13培养的阶段对应突变的比例显著地上升到(17-36%)[4]。

6.3 基因表达分析

实时荧光定量PCR 常用于检测基因表达差异，但该方法一般只能检测出两倍或者更大的差异。而一些研究则需要检测低于两倍的表达变化。dPCR 的检测精度可达±10%甚至更高，能够分辨更小的差异。

dPCR尤其适合：基因相对表达变化差异较小（<2倍）的研究；低丰度基因或单细胞的表达分析，以及RNA编辑、等位基因差异表达等研究。

图13. 基因表达分析相关方法比较

6.4 拷贝数变异分析

图14. 拷贝数变异

拷贝数变异 (CNV) 分析的目的是确认目的序列的拷贝数是否偏离野生型序列，以及偏差多少。拷贝数变异与疾病（癌症）、代谢途径、生物种进化等关系密切。临床上，CNV可为具体治疗方案的制定与修正提供参考；农业及畜牧业，CNV可作为遗传育种的遗传标记。

传统实时荧光定量PCR平台提供了足够的分辨率，可以鉴别低拷贝数 (如0至5的拷贝数)；但更高的拷贝数需要更精确的测量，以确定确切的拷贝数。dPCR尤其适用于更高拷贝数分析，检测精度超过±10%。

参考文献：

1. Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical cancer research, 2014, 20(6): 1698-1705.

2. Persaud D, Gay H, Ziemniak C, et al. Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(19): 1828-1835.

3. Huang J T, Liu Y J, Wang J, et al. Next generation digital PCR measurement of hepatitis B virus copy number in formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue[J]. Clinical chemistry, 2015, 61(1): 290-296.

4. Cai J, Miao X, Li Y, et al. Whole-genome sequencing identifies genetic variances in culture-expanded human mesenchymal stem cells[J]. Stem cell reports, 2014, 3(2): 227-233.