数字PCR应用（二）

4、能够有效区分浓度差异（变化）微小的样品：更好的准确度、精密度和重复性，可以用于精确测定靶基因的相对表达，基因拷贝数变异分析等。

图4. qPCR和dPCR的对比

四．dPCR的多指标检测的实现

如同qPCR一样，dPCR中实现多指标的并行检测能显著降低检测成本，获取更丰富的检测信息。

不同于qPCR中的多腔室扩增与多荧光通道结合的并行PCR方式，在dPCR里，一个微反应腔室里一般只含一种靶基因。

图5. dPCR的多指标并行检测的实现方式

所以dPCR的多指标检测主要通过以下两种方式实现：

1. 多个荧光通道。使用多种荧光染料来标记不同的要检测的靶基因。

2. 单波长多强度。使用一种荧光染料，但是扩增结束时不同的靶基因对应的染料的荧光强度不一样。

五．dPCR的分类以及相关的产品

微流控芯片技术能够快速并准确地将样品流体分成若干个独立的单元, 从而进行多步平行反应，并且具有成本低、体积小和高通量等特点，是理想的数字PCR平台。按照其独立的单元的实现方式来细分，dPCR又分为基于液滴微流控（droplet microfluidics）的微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）和基于芯片式微流控的微阵列芯片式PCR。

5.1微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）

微滴数字PCR主要是将两种互不相溶的液体，以其中一种作为连续相（油），另一种作为分散相（水），在水/油两相表面张力和剪切共同作用下分散相以微小体积单元的形式存在于连续中，从而成液滴。这种液滴式的反应腔室具有体积小、样品间无扩散等优势。

在ddPCR中，利用微滴发生器可以一次生成数万乃至百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，作为数字 PCR 的样品分散载体。这里，液滴中包裹了单拷贝DNA模板和PCR反应液，然后将液滴收集在PCR反应管中进行扩增。ØPCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。

目前Bio-Rad公司的QX100系统、QX200系统均为采用液滴技术的数字PCR系统。

图6. Bio-Rad的droplet digital PCR系统

5.2 微阵列芯片式PCR

微阵列芯片式PCR主要通过芯片设计将纳升液体封闭在高通量的微池或微量通道中进行后续的PCR扩增及扩增后结果的荧光显微镜直接判读。

按芯片设计方式，微阵列芯片式PCR又可以分为阵列微池式芯片、滑片式芯片和集成微泵阀芯片：

1. 阵列微池式芯片上刻蚀有微池阵列，反应液由进样孔直接导入个反应微池；

2. 滑片式芯片是设计带有微流体通道和反应单元的玻璃芯片，上下两篇玻璃芯片间用油相密封，通过滑动芯片将样品溶液从液体通道引入反应单元，同时生成成百上千个微反应滴阵列；

3. 集成微泵阀式芯片是通过多层软刻蚀技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上加工交织的液体和气体通道结构，通过精确地控制微泵阀的开启和关闭，快速并准确地将流体分成若干个阵列的独立单元。

2010年，Life Technologies也推出了基于阵列微池式芯片的数字PCR产品线–OpenArray系统。它提供的TaqMan OpenArray 数字PCR试剂盒可在OpenArray平板上运行。平板可在现有的OpenArray 实时定量PCR系统以及新上市的QuantStudio™ 12K Flex仪器上运行。OpenArray 实时定量PCR系统能够同时运行3块OpenArray平板。

图7. TaqMan® OpenArray® Digital PCR系统