数字PCR简介

1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以后，PCR已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。PCR是用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点，是能将微量DNA大量扩增。

最传统的一代PCR采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析，操作繁琐、难于做定量分析。为使PCR技术能对基因水平进行定量分析，1992年开发了荧光实时定量PCR（二代PCR）。实时定量PCR（qPCR）通常在DNA扩增时对反应体系中的荧光信号进行实时收集，通过三个参数间（荧光信号-Cq值（罗氏公司）或Ct值（ABI公司）-靶基因的起始浓度）的关系，能以相对定量的方式确定靶基因的拷贝数或推断基因表达水平。由于荧光定量PCR的分析是相对定量的方式，这也是目前荧光定量PCR的最大技术缺点。在低拷贝靶分子、模板浓度差异的条件下，其检测灵敏度、精确度都受到了限制。
1999年霍普金斯大学的Vogelstein教授首先提出了第三代的Digital PCR（数字PCR）的概念。此后数字PCR技术得到迅速的发展。数字PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR相比，数字PCR增加了一步分隔(partitioning)的操作，将几十微升的反应体系分隔成了众多微小独立反应体系。核酸模板在这种分割过程中被充分稀释，理想状态下每个微反应体系中至多含有1个分子的核酸模板。和qPCR不同，数字PCR不对扩增过程进行实时监测，而是检测end-point的荧光信号。扩增完成后所有液滴的荧光将逐个被识别并进行计数，不需要构建标准曲线，就可以得到绝对定量的结果。
目前数字PCR的主要产品有：
1. QX200

 QX200目前已经是Bio-Rad的产品。Bio-Rad的技术主要来源于QuantaLife公  司，QuantaLife 利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字ddPCR，这是最早出现的相对成熟的数字PCR平台，在运行成本和实验结果稳定性方面都基本达到了商品化的标准。 2011年QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100，继续在市场上销售，2013年该公司又推出了升级型号QX200。
2. Raindrop

Raindrop数字PCR是美国RainDance Technologies公司于2012年推出的产品。能够提供更高的检测范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品，这个设备将其原有的二代测序文库制备平台技术也整合进入数字PCR技术平台，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成100万至1000万个P升级微滴反应乳液，这种超高的微滴数目可以为用户“提供更高的检测动态范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品。在2017年Bio-Rad完成了对RainDance公司的收购。
3. Quant Studio 3D

Applied Biosystems 公司2013年也推出了Quant Studio 3D数字PCR系统，是目前数字PCR市场上新型号产品之一。采用高密度流控芯片技术，使样本均匀分配至20,000个单独的反应孔中。在整个测定流程中，样本之间保持完全隔离，防止样品交叉污染。移液过程和操作步骤减少。芯片式设计避免了微滴式系统可能出现的管路堵塞问题。Applied Biosystems在OpenArray芯片平台之外推出的全新的芯片式数字PCR系统，这个全新系统在设计上综合考虑了系统稳定性与运行成本因素。 2013年Thermo Fisher公司收购了Applied Biosystems。 
Quant Studio 3D 数字PCR可用于分子标准品定量；原体检测和定量测定；罕见癌症基因突变检测；拷贝数变异分析；GMO检测和污染评估；mRNA 和miRNA表达低倍变化的确定等。
4. Naica TM crystal

Naica™ crystal数字PCR系统是由法国Stilla Technologies公司推出的产品。将微滴均匀性和芯片可视化以及相同PCR反应条件创新性集成在同一系统中，使用微流体创新型Sapphire芯片，样品通过毛细通道网格以30,000个Crystal微滴的形式进入发布在2D芯片中。 这种方法在满足实验室对数据精准性、重复性要求的同时，让数字PCR分子检测变得更加简单快捷。PCR扩增过程在芯片上实现。最终对阳性微滴计数从而得到精准的核酸绝对数量。作为首款三个荧光通道检测的数字PCR平台，Naica™ crystal数字PCR系统可在2小时内实现多达36个目标基因的检测。Naica™ Crystal系统由Geode微滴生成；扩增仪和Prism3微滴阅读分析系统组成，仅需唯一耗材——Sapphire芯片，即可完成从加样、微滴生成和扩增，直到采集数据获得结果。　r> Naica™ crystal数字PCR可用于：基因表达差异检测；拷贝数变异(CNV)；低丰度及稀有序列的精确定量；甲基化含量鉴定；肿瘤治疗的伴随诊断；无创产前筛查；病原微生物的检测(病毒、细菌等)；二代测序辅助建库；肿瘤治疗的实时监控 (ctDNA检测)等。