氨基酸单向纸层析实验原理和步骤(1)

一、实验目的：
1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层析
的原理和操作技术；
2、掌握分配层析法；
3、掌握影响分配系数的因素。

层析分离技术是利用被分离的混合物中各组分物理化学的性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相（流动相和固定相）中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离。

层析分离技术在20世纪初就已得到应用；
1903年用于植物色素的分离；
1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；
1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析。
层析分离的种类很多：
1、按流动相的状态分类：
（1）液相层析（2）气相层析；
2、按固定相的使用形式分类：
（1）柱层析（2）纸层析（3）薄层层析等；
3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：
（1）吸附层析（2）分配层析（3）离子交换层析
（4）凝胶层析（5）亲和层析等。

二、实验原理
纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。

溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。
移动速率：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。
影响Rf值的主要因素：
Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，Rf也就不同。
（1）物质的结构和分子极性：
结构不同极性不同，在两相中的溶解度也就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之Rf则较大；
（2）层析溶剂：
首先，溶剂的纯度要高，否则需经预先处理（酸碱抽提，重蒸馏，脱水干燥等）；其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.05～0.85，样品被分离物质的组分的Rf之差最好大于0.05。再次，有些溶剂系统需必须新鲜配制，如正丁醇-甲酸-水系统久放易引起酯化；最后，溶质和溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响很大；
（3）pH 值：
溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf改变；溶剂的pH还可以影响流动相的含水量，溶剂的酸碱度大，吸水量多，使极性物质的Rf增加（将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理）；