氨基酸的纸层析(paperchrmatography)

一、 实验目的
1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。
2.学习纸层析法的操作技术，分析未知样品氨基酸的成分。
二、 实验原理
用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法，它是分配层析法的一种。纸层析所用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的—OH 基的亲水性基团，可吸附有机溶剂中的水作为固定相，有机溶剂作为流动相，它沿滤纸自下向上移动，称为上行层析；反之，使有机溶剂自上而下移动，称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由于它们各自的分配系数不同，故在流动相中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。纸层析法主要是依据混合组分对二相分配系数的差异进行分离，但亦存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象。氨基酸经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点，氨基酸在滤纸上的移动速率用Rf 表示。
Rf = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
只要实验条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变，Rf 值是常数，因此可做定性分析参考。如果溶质中氨基酸组分较多或其中某些组分的Rf 值相同或近似，用单向层析不宜将它们分开，为此可进行双向层析，在第一溶剂展开后将滤纸转动90度，以第一次展层所得的层析点为原点，再用另一种溶剂展层，即可达到分离目的。由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析点显色，从而定性和定量。
三、仪器和试剂
仪器
层析滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、培养皿、猴头喷雾器、微量加样器或毛细管、吹风机一个、直
尺、铅笔等。
试剂
1.混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉)
甘氨酸溶液：50mg 甘氨酸溶于5mL 水中。
蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶于5mL 水中。
亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶于5mL 水中。
氨基酸混合液： 甘氨酸50mg，亮氨酸25mg，蛋氨酸25mg 共溶于5mL 水中。
2. 展层溶剂
碱相溶剂：正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇 = 13∶13∶13(V/V)
酸相溶剂：正丁醇∶80%甲酸∶水 = 15∶3∶2(V/V)，摇匀后放置半天以上，取上清液备用。
3.显色贮备液： 0.4mol/L 茚三酮—异丙醇∶甲酸∶水=20∶1∶5。
4.0.1% 硫酸铜：75%乙醇=2∶38，临用前按比例混合。
四、实验步骤
(1)标准氨基酸单向上行层析法
1.画基线
戴上指套或橡皮手套，在长约20cm、宽约17cm 滤纸上，距短边2.5cm 处，用铅笔画一条线，即为基线。
2. 点样
在原线上，从距纸的长边4cm处开始，每隔3cm 用微量注射器或毛细管依次分别点上甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和混合氨基酸溶液。点样点干后可重复点加1～2次。每一点的直径不超过2mm，点样量以每种氨基酸含5～20ug 为宜。
3.展层
将点好样的滤纸卷成筒形，滤纸两边不相接触，用线固定好，将原线的下端浸入盛有溶剂的培养皿中，不需平衡可立即展层。展层剂为酸性溶剂系统，在展层溶剂中加入显色贮备液(每10mL 展层剂加0.1～0.5mL 的显色贮备液)进行展层，基线必须保持在液面之上，以免氨基酸与溶剂直接接触。盖好层析缸，当溶剂前沿距纸端2cm 时(大约3h)，取出滤纸。
4. 显色
滤纸取出后，吹干或在80℃左右烘箱内烘3～5min，即出现紫红色的氨基酸层析斑点。用铅笔划下层析斑点，可进行定性、定量测定。
(2) 混合氨基酸双向上行纸层析法
1.滤纸准备
将滤纸裁成约28cm2的正方形，在距滤纸相邻两边各2cm 处的交点上，用铅笔划下一点，做为原点。
2.点样
取混合氨基酸溶液(5mg/mL)10～15μL，分别点在原点上。
3.展层与显色
将点好样的滤纸卷成半筒形，立在培养皿中，原点应在下端。取少量12%的氨水与小烧杯中，盖好层析缸，平衡过夜。次日，取出氨水，加适量碱相溶剂(第一向)与培养皿中，盖好层析缸，上行展层，当溶剂前沿距滤纸上端1～2cm 时，取出滤纸，冷风吹干。将滤纸转90o，再卷成半筒形，竖立在干净培养皿中，并于小烧杯中至少量酸相溶剂，盖好层析缸，平衡过夜，次日将加显色剂的酸性溶剂(每10mL 展层剂加0.1～0.5mL 的显色贮备液)倾入培养皿中，进行第2向展层。展层毕，取出滤纸，用热风吹干，蓝紫色斑点即显现。
五、计算
单向层析的Rf 值，按 “Rf = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离”计量后计算。双向层析Rf 值，由两个数值组成，在第一向计量一次，第二向计量一次，分别与已知的氨基酸在酸碱系统的Rf 值对比，即可初步决定它为何种氨基酸的斑点，将它剪下，在同一张纸剪下一块大小相同的空白纸作为对照，用硫酸铜—乙醇溶液洗脱，用722型分光光度计测定其吸光度，在标准曲线上查出氨基酸的含量。