水质对HPLC分析的影响

　　简介：

　　优化的高效液相色谱法分析需要高纯度溶剂和试剂。同时，在流动相准备阶段，色谱柱中盐和有机溶剂的选择十分谨慎，所以水质是非常重要的。在洗脱液中，中痕量有机物的存在可能会导致长期不好的结果。随着时间推移，柱效可能会阻塞，导致分辨率降低，峰拖尾。大量实验表明，水中的有机物可能极大地影响液相色谱-质谱分析的结果。有机污染物易电离，就会与分析物结合，从而影响实验结果。

　　研究的目的：

　　本研究旨在探讨水质对高效液相色谱法分析的影响。首先，使用去离子的水、 双蒸馏水，HPLC 级别瓶装水、 新鲜超纯水和存储超纯水进行基线比较。此外，用七种药物混合物利用梯度的乙腈与市面上的瓶装水、新鲜纯净的水这两种不同水质作前处理流动相，反复进行分析 (1310 次)，进行色谱图比较。

　　分析方法：

　　1. 高效液相色谱基线研究：

　　仪器：高效液相色谱系统 Alliance® 2695。检测器: PDA 模型 2996，设置在 210 nm

　　列: X Terra ® MS (C18，2.1 毫米 x 150 毫米 x 2.5 μ m)

　　流动相：高效液相色谱级乙腈 (J.T.Baker)，高效液相色谱级瓶装水 (Chromanorm，Prolabo)，双蒸水，Milli-Q Gradient A10 (Millipore)所制造的新鲜水，水净化系统中在 UV 灯氧化之前所制备的水。

　　程序

　　样品制备: 在 HPLC 分析之前 60 毫升的水样品被富集在 X Terra MS (C18 ,4.6 x 30 毫米 x 3.5μm)

　　按照以下的梯度洗脱 (水: 乙腈):

　　100%到 0%水中 30 分钟

　　再 80%水 10 分钟

　　ESI + 实验使用 Waters Micromass® ZQ™2000

　　2. 药物混合料研究:

　　仪器：高效液相色谱系统: Waters 510 HPLC 色谱泵；717 加自动进样器；9966 光电二极管阵列，设置在190-400 毫微米的探测器；列: SymmetryShield RP18 (Waters), 3.5 μ m，4.6 x 150 毫米。

　　药物混合

　　以下按照色谱药品标准来自 Alltech 浓度 1 毫克/毫升，

　　在甲醇溶解: (1) 对乙酰氨基酚、 乙酰唑胺 (2)、 苯巴比妥 (3)、卡马西平 (4)、苯妥英 (5)、 (6) 速可和萘丁美酮 (7)。混合物制备每种药品含 0.200 μ g/m l 的。

　　流动相：高效液相色谱级乙腈 (Fisher)，HPLC 级瓶装水 (Fisher) 和 Milli-Q Gradient A10 (Millipore)并通过 0.22 微米的 Millipak ®所制造的新鲜水以及水净化系统中在 UV 灯氧化之前所制备的水。

　　程序

　　25 μ L 注射药物混合通过 0.45 μ m 13 毫米 Millex ®-LCR 过滤装置过滤。

　　按照以下的梯度洗脱 (水: 乙腈)

　　组分的混合物的分离:

　　80%至 30%水的 15 分钟

　　30%至 80%水 1 分钟，再进行 80%水 4 分钟

　　水的纯化：

　　自来水通过多种纯化技术的组合生产出纯水：

　　需求:用于实验用水的超纯水需要达到(电阻率是在 18.2 MW.cm25 ° C)，并且总有机碳 (TOC)包含少于 5ppb

　　结果和讨论--基线研究

　　长久以来，双蒸水在实验室"黄金标准"用水，但现在已知它含有有机污染物: 某些污染物可能随之水蒸汽蒸发，而某些则残留在水中。这可能会导致高效液相色谱基线背景强烈。

　　高效液相色谱级瓶装水还可能包含某些有机污染物 (图 1)

　　通过 LC-MS，我们可以看到蒸馏水和瓶装水中有机污染物的存在 (图 2)。而在超纯水中，紫外线光氧化是有效的消除有机物。

　　将一个装有超纯水的玻璃瓶暴露在实验室中。在图 3 可以看到污染物在水中的表现。超纯水是一种优良的溶剂，很容易地被实验室大气层中存在有机物质所污染。

　　结果和讨论--药物混合物研究

　　使用不同水源作为流动相利用高效液相色谱法分离 7 药物，反复重复实验 1310 次(图 4)。

　　图 4，以 HPLC 级瓶装水和乙腈作为流动相，在 214nm 药物混合物色谱图 (1) 对乙酰氨基酚、 乙酰唑胺(2)、 苯巴比妥 (3)、卡马西平 (4)、苯妥英 (5)、 (6) 速可和萘丁美酮 (7)

　　当 HPLC 级瓶装的水用于制备流动相，基线漂移随着实验次数的增加而发生变化 (图 5A)。而当时使用超纯水基线趋于稳定 (图 5B)。

　　基线漂移同样出现在 254 nm 时采用 HPLC 级瓶装水作为流动相 (图 6A 和 B)。当 HPLC 级瓶装水，随着时间的推移，大约在洗脱的 5 分钟时鬼峰出现。(图 6A)。而实验超纯水并没有出现鬼峰(图 6B)。

　　鬼峰可能是由于集中在色谱填料上的有机污染物被释放。基线漂移可能是由于瓶装水所释放出的有机杂质所带入的。

　　使用新鲜带有的极其少量污染物（有机物含量极低）的超纯水优于 HPLC 级瓶装水，即使在 1310 注射后仍能保证稳定的基线和没有杂峰的出现。

　　总结：

　　使用高效的预处理系统，通过 UV 光氧化处理，能有效去除水中有机杂质，提供优质的超纯水，相比较瓶装 HPLC 级别瓶装水，这种高质量水的使用大大减少基线漂移和限制高相液相色谱法中的杂峰出现。使用新鲜生产纯水且低 TOC (< 5ppb) 作为流动相有助于达到并维持良好的色谱性能。这种实验用水非常适合于灵敏度高的方法，如液相色谱-质谱。