痘苗病毒DNA提取实验

实验方法原理

实验材料 纯化的痘苗病毒

试剂、试剂盒 Tris•Cl 溶液SDS蔗糖溶液 蛋白酶 K用 50 mmol／L Tris • Cl 溶液平衡的苯酚1：1苯酚氯仿1 mol／L 乙酸钠乙醇

仪器、耗材 分光光度计Sorvall 离心机

实验步骤

1. 在 260 nm 处确定纯化的疸苗病毒的光密度，将 20 个光密度单位的病毒（见「痘苗病毒纯化实验」 步骤 24）加入到 50 mmol/L pH 7.8 的 Tris • Cl 缓冲液中，终体积为 1.2 ml。

2. 将以下溶液加到病毒悬液中（终体积为 2 ml）：

0. 1 ml 1 mol/L pH 7.8 的 Tris • Cl

0.1 ml 10％ SDS

0.2 ml 60％ 蔗糖溶液

0.4 ml 10 mg/ml 蛋白酶 K

37℃ 温育 4 h。

3. 用苯酚抽提 2 次，每次加入等体积的平衡苯酚，摇动离心管轻轻混匀，室温，300 g 离心 10 min，用去掉头部的枪头将上层水相吸出保留。

4. 用步骤 3 所述的方法，再用 1:1 的苯酚氯仿抽提 1 次。

5. 加入 1/10 体积的 1 mol/L pH 7.0 的乙酸钠和 2.5 体积的 100％ 乙醇。轻轻混匀，并在 -20℃ 冷冻几个小时。

6. 以最大的速度 4℃ 微量离心 10 min，吸弃上清。

7. 用 95％ 乙醇清洗沉淀 2 次，每次加入乙醇后以最大速度微量离心，吸出上清。空气干燥后用 100 μl 的水溶解。

8. 制备稀释液（仅取一小部分），用 A260 测定 DNA 浓度。

注意事项

在本操作中不要涡旋 DNA。因为痘苗病毒的基因组很大，如果想得到完整长度的 DNA（如用于限制酶切分析）就必须小心操作，以免剪切 DNA。