砷钼酸比色法测定还原糖含量

一、目的
植物体内的还原糖主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是合成其它成分碳架来源和呼吸作用的基质。此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。其它碳水化合物，如淀粉、蔗糖等，经水解也生成还原糖。因此，测定还原糖的方法在研究植物体内生理生化变化和测定植物体内碳水化合物方面都是很重要的。
二，原理；
还原糖是具有羰基（>C=O）的糖，能将其它物质还原而其本身被氧化。
(1) 还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下：

（2）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量（即被还原的Cu₂O 量）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料
苹果、面粉等
2．主要仪器
（1）分光光度计
（2）水浴锅
（3）具塞刻度试管：20mL×10
（4）刻度吸管：1 mL×1，2 mL×4，5 mL×3
（5）容量瓶：100 mL×2
（6）漏斗
（7）研钵
3．试剂
（1）铜试剂：
A、4％CuSO45H2O
B、称取24g 无水碳酸钠，用850mL 水溶于大烧杯中，加入2g 含4 分子结晶水的酒石酸钾钠，待全溶（应加热）后加入碳酸氢钠16g，再加入120g 无水硫酸钠（加热），全溶及冷却后加水至900mL，沉淀1～2d，取上清液（要求严格时过滤）备用。使用前将A 与B 按1∶9 混匀即可使用。
（2）砷钼酸试剂：25g 钼酸铵 ( NH4)6Mo7O24·4H2O 溶于450mL 蒸馏水中（加热溶解，但温度接近150℃时易分解），待冷却后再加入21mL 浓H2SO4 混匀。另将3g 砷酸氢二钠(Na2HasO4·7H2O)溶解于25mL 蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中可长期使用。
（3）200μg／mL 标准葡萄糖原液：准确称取分析纯葡萄糖200mg，溶解定容到1000mL。
四、操作步骤
1．标准曲线的制作：
在一系列刻度试管中，分别加入200μg／mL 标准葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6 mL，再顺序加入蒸馏水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 及1.4 mL，配成浓度分别为0、10、20、30、40、50 及60μg/mL 的系列葡萄糖溶液。每试管加入铜试剂2mL，混匀后沸水浴中加热10min，立即冷却，再加入2mL 砷钼酸试剂，振荡两分钟后稀释到20mL，用分光光度计在620nm 波长下比色，测其光密度OD620nm（做一式两份）。以糖浓度微克数为横坐标，光密度OD620nm 为纵坐标，绘制标准曲线。
2．植物样品中还原糖的提取：
将样品洗净，吸干其表面水分，切碎混匀，称取1g 放入研钵中，加入约0.5g 石英砂，磨成匀浆，加水将样品由玻璃漏斗冲入100mL 容量瓶中，加水达70～80mL，摇匀后置于80℃恒温水浴上浸提0.5h。
待上述样品冷却后，沉淀蛋白质，加入5％硫酸锌5mL，再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL，以沉淀蛋白质。振荡后静置，至上层出现清液后再加一滴Ba(OH)2，直至无白色沉淀时，向容量瓶加水至刻度。
3．还原糖含量的测定：
过滤上述已定容的样品液，取5mL 滤液，再定容到100mL（此步视样品的含糖量而定）。取已稀释的溶液2mL，与标准葡萄糖显色法相同：加铜试剂2mL，煮沸10min，加砷钼酸试剂 2mL，振荡2mL，定容到15ml，620nm 波长下比色，记下光密度OD620nm（至少重复两次）。
五，结果计算

式中：G 从标准曲线上查得含糖量（μg）。