让基因组测序绕过PCR扩增

　　在基因组测序中，PCR扩增似乎是绕不过去的一步。然而，PCR也带来一些问题，包括不均匀扩增，导致某些序列的比例过高。对目前的新一代测序（NGS）平台而言，测序某些碱基组成上存在严重偏向的基因组区域仍是一大挑战。在GEN杂志上，Patricia Fitzpatrick Dimond博士介绍了PCR-Free的基因组测序。

　　文库制备的变革

　　2009年，Sanger研究院的Iwanka Kozarewa博士及其同事介绍了一种无需扩增的Illumina文库制备方法（Nature Methods 2009；6:291–295）。他们表示，GC偏向的基因组的定位和组装有所改善。这种方法采用簇扩增步骤来富集完全连接的模板链，降低了重复序列的发生率，改善了序列定位和SNP检出。

　　这种方法的核心是采用no-PCR接头，它们包含额外的序列，让模板能够与流动槽表面直接杂交，这样就不再需要PCR步骤。作者表示，通过此方法产生的DNA模板量低于PCR方法，但定量研究表明，从5 μg起始DNA中获得的文库足够400个GA通道的测序，这满足了大多数的实验需求。此外，由于省去了PCR步骤，这种方法比标准的文库制备更快。

　　Illumina的产品经理Rooz Golshani表示：“我们的PCR-free产品，TruSeq® DNA PCR-Free Library Preparation Kit，是金标准，也是产生最完整基因组的最佳方案。”Golshani博士指出，研究人员在需要避免PCR相关的偏向时，往往采用此试剂盒来制备文库。

　　2015年，J. Craig Venter研究所的Marcus B. Jones及其同事指出，随着全基因组测序被广泛用于人类微生物组研究，研究结果往往被证明是冲突或不确定的（Proc Natl Acad Sci USA 2015；10；112:14024-9）。

　　研究人员开展定量和定性分析来比较WGS宏基因组数据。他们采用Illumina Nextera XT和TruSeq DNA PCR-Free以及KAPA Biosystems的Hyper Prep PCR和PCR-Free系统。研究表明，这四种不同的NGS文库制备导致分类出现明显差异。根据分析的结果，他们建议从事微生物组研究的研究人员采用PCR-free的方法来减少PCR偏向，从而获得更准确的分类信息。

　　纳米孔测序

　　这些PCR-free的技术都是针对Illumina的测序仪开发的，不过，一种颠覆性的测序技术已经彻底改变DNA测序的方式，这就是纳米孔测序。

　　Oxford Nanopore Technologies开发的手机大小的MinION测序仪有望最终抛弃PCR。它读取长的DNA片段，不过目前仍需要文库制备。这种方法在分辨重复序列或单体型上具有优势，因为单个测序片段就能跨越含糊不清的区域。未来，这种设备有望用于实时医疗诊断和法医检验。

　　不过，英国研究人员认为，在广泛采用MinION之前，需要评估其通量和准确性（Biomol Detect Quantif 2015；3: 1–8）。他们利用MinION对三个细菌基因组进行重测序，这些有着不同的核苷酸组成。研究人员发现，MinION碱基检出后的错误率为38.2%。读长平均值和中值分别为2 kb和1 kb，而最长的序列达到98 kb。作者认为，尽管错误率限制了MinION的竞争能力，但是与Illumina MiSeq的数据相结合，MinION的序列数据可增强de novo组装。

　　随着MinION的试用报告不断出炉，人们发现，MinION本身也能做很多事情。它能可靠地测序小型基因组，如细菌和酵母。它也能区分亲缘关系很近的细菌和病毒，读取人类基因组中的复杂区域，并区分一对染色体上的两个基因版本。此外，传染病检测也有望成为这种手持式测序仪的一大应用。