PIK3CA顺式双突变增加乳腺癌患者对PI3Kα抑制剂的敏感性

　　在所有肿瘤中，PIK3CA是最常见发生突变的原癌基因【1】。它编码的p110α，组成负责细胞正常生长增殖的磷酸肌苷3激酶(phosphoinositide3-kinase alpha, PI3Kα)复合物的催化亚基【2】。p85α组成PI3Kα的调控亚基。PI3Kα磷酸化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(lipidphosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2) 生成3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol3,4,5-trisphosphate, PIP3)，触发下游一系列信号级联反应包括AKT和哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycinm, mTOR)的激活【3】。PI3Kα结合膜结合受体酪氨酸激酶(membrane-boundreceptor tyrosine kinases, RTKs)或发生基因突变从而激活。已经发现了许多肿瘤相关的PIK3CA突变，如热点突变E542K、E545K和H1047R【4】。这些突变在多种癌症组织中被认为是致癌的【5,6】，例如在乳腺癌中【7,8】，40%的雌激素受体阳性(estrogenreceptor–positive, ER+)，人表皮生长因子受体2-阴性(humanepidermal growth factor receptor 2– negative, HER2 -)的原发性和继发性肿瘤存在PIK3CA突变，并把其作为治疗靶点【9】。

　　基于上述发现，特异性程度不同的PI3K抑制剂开始在PIK3CA突变乳腺癌患者的临床试验中被研究。虽然药物毒性阻止了大部分抑制剂进入临床，但一些不太特异的化合物的初步研究显示它们具有活性【10-13】。最近，选择性PI3Kα抑制剂塔塞利西卜(alpelisib)显示出了更好的耐受性【14-16】，一项大型随机3期临床试验显示，ER+PIK3CA突变的转移性乳腺癌患者的无进展生存期(improvedprogression-free survival, PFS)在用药后得到了改善。因此，alpelisib最近被美国食品和药物管理局批准用于治疗携带PIK3CA突变的晚期ER+乳腺癌患者。

　　在早期的临床试验中，也观察到有一群患者从alpelisib中获得了深刻而长期的临床效益【14,17】。然而，PI3K抑制剂改善乳腺癌患者临床反应背后的具体机制还不是很清楚。

　　2019年11月8日，来自美国纽约纪念斯隆凯特琳癌症中心的José Baselga教授带领的团队在Science发表题为“Double PIK3CA mutations in cis increaseoncogenicity and sensitivity to PI3Kα inhibitors”的长文，在这里，研究者以PIK3CA双突变作为研究对象。对PIK3CA突变进行了流行性分析，并研究了其潜在的生物学意义以及与PI3Kα抑制剂的关系。

　　研究团队之前报道了一位乳腺癌患者，他对alpelisib单药治疗具有高度持久的反应，最终通过聚合PTEN突变产生抗病性(acquiredresistance)【17】。在该患者的原发和转移病灶中，还检测到PIK3CA双突变的存在，且两种突变的变异等位基因频率(variantallele frequencies, VAFs)相同。接着，他们从I期临床试验中挑出50名ER+转移性乳腺癌患者来调查他们对alpelisib和芳香酶(aromatase)抑制剂共同用药后的效果，并通过二代测序检测PIK3CA突变状态。结果显示，PIK3CA双突变型肿瘤患者的中位无进展生存期（progression-freesurvival，PFS）比单突变型或野生型(wild-type,WT)肿瘤患者的要长，但由于病例数量较少，因此无统计学意义。但是，单独接受芳香酶抑制剂或ER受体抑制剂氟维司琼(fulvestrant)的治疗，PIK3CA双突变型肿瘤患者的PFS则没有表现出比单突变型或野生型肿瘤患者的要长。因此，他们假设PIK3CA双突变乳腺癌患者对alpelisib的敏感是由于PI3K受到了抑制而非通过激素途径。

　　那么，这种现象是否具有普遍性呢？研究人员分析了来自cBioPortal的一个公开的癌症患者数据库(n =70,754) 【19,20】，共识别出4526个PIK3CA突变的肿瘤，其中576个(13%)包含多个PIK3CA突变。研究人员紧接着又分析了来自纪念斯隆凯特琳癌症中心的一个数据库，对不同癌症类型的转移性肿瘤(n= 28139)进行了富集，鉴定出3740个PIK3CA突变的肿瘤，其中451个(12%)包含多个PIK3CA突变【18】。在cBioPortal和纪念斯隆凯特琳癌症中心组中，乳腺癌、子宫癌和结肠直肠癌具有最多的多PIK3CA突变肿瘤。他们还分析了乳腺癌亚群，发现多PIK3CA突变肿瘤在乳腺癌国际联盟分子分类学(METABRIC)，癌症基因组图谱(TCGA)或其它的据库中发生的频率相似。在所有这些患者群体中，大多数(88 -96%)PIK3CA多突变的肿瘤恰好携带双突变。

　　接下来，他们以乳腺癌为例研究了PIK3CA双突变的潜在模式。在大多数PIK3CA双突变的乳腺肿瘤中，其中一个突变是螺旋或激酶域的主要热点突变(涉及E542、E545或H1047)，这些突变在单突变肿瘤或多突变肿瘤中都很常见，并且出现频率相同。通过密码子富集分析，他们发现第二个突变E726、E453或M1043在多突变肿瘤中的出现频率却远远高于单突变肿瘤。有趣的是，几乎所有含有第二个突变E726、E453或M1043的肿瘤均含有第一个突变E542、E545或H1047。为了确定双突变体是否存在于同一个细胞中，他们使用FACETS(肿瘤测序中的片段和等位基因特异性拷贝数估计值)工具来分析乳腺癌数据库(n =1918)双突变体肿瘤的克隆性。结果发现，在最常见的双突变组合如E545K或H1047R热点突变加上E453,E726, 或M1043中，62个中的42个(68%)没有克隆性。这个结果说明双突变存在于同一细胞中。细胞中同一基因的任意两个突变可能是在同一个等位基因(顺式)或不同的等位基因(反式)。顺式突变会产生一个有两个突变的蛋白质，而反式突变会产生两个有单独突变的蛋白质，这些可能会产生不同的功能结果。因此，确定PIK3CA双突变的等位基因结构很重要。他们使用单分子实时测序(singlemolecule real-time sequencing, SMRT-seq) 法，一种以环状DNA为模板的远程测序，能直接获得在基因组上相隔很远的所有重复的PIK3CA双突变的等位基因结构。他们对6例含最常见的双突变乳腺癌患者新鲜肿瘤标本，包括E542K-E726K、E545K-E726K、E453K-H1047R、E545KM1043L双PIK3CA突变，进行SMRT-seq分析，结果发现所有双突变都是顺式双突变。

　　他们推测，PIK3CA顺式双突变体表现超等位基因功能，因为它们编码的单突变蛋白分子具有不同的激活能力。因此，他们以E453Q/E545K、E453Q/H1047R、E545K/E726K、E726K/H1047R、E545K/M1043L顺式双突变体及其单突变为研究对象，探讨PIK3CA双突变对PI3K通路激活和细胞增殖的影响。他们在MCF10A乳腺上皮细胞和NIH-3T3小鼠成纤维细胞中稳定地过表达了每个顺式双突变体和其组成单一突变体，并且设计在MCF7ER+乳腺癌细胞中携带PIK3CAWT背景。结果显示，与PIK3CA单突变相比，PIK3CA双突变增加下游PI3K通路信号，表现为在血清饥饿的情况下AKT，PRAS40 和S6的磷酸化增强，并能维持磷酸化长达48小时。另外，细胞增殖也显著增强。接下来，他们想确认在体内是否能促进肿瘤生长。与H1047R或E726K单突变相比，表达E726K/H1047R顺式突变体的NIH-3T3同种异体移植物的肿瘤生长有所增加。之前的文献报道，单突变体和WT在肿瘤生长方面没有差异。与此同时，E726K/H1047R顺式双突变体NIH-3T3在细胞培养中也表现出较高的PI3K通路激活。这些实验结果都说明，PIK3CA的顺式双突变，将单个突变的生物学作用进行结合，从而能过度激活PI3K并增强增殖。

　　那么，PIK3CA顺式双突变激活PI3Kα的生化机制是什么呢？p110α与p85α组成PI3Kα复合物，这种相互作用稳定了其结构，并抑制了其催化活性。PI3Kα激活的普遍模式是通过磷酸络氨酸与p85的结合释放p85α，从而缓解催化抑制。在没有磷酸酪氨酸结合的情况下，单个致癌突变以独特的方式进行这些事件，可通过弱化p110α和p85α之间的相互作用(破坏突变，disrupters)或促进与膜的结合(结合突变，binders)。从结构上看，研究人员假设E545K和E453Q起干扰作用，而E726KH1047R, 和M1043L起促结合作用。接下来，他们使用热位移法模拟p85α的顺式突变中断，这种方法使蛋白质暴露在不断升高的温度下以确定熔化温度。不稳定的蛋白质在较低的温度下容易变性和聚集。p110α依赖于与p85α的相互作用来正确折叠，削弱它们的相互作用会使它们变得热不稳定。结果发现，测试的所有顺式双突变体的热不稳定性均比单突变高，这意味着PIK3CA顺式双突变削弱了p110α与p85α的相互作用。为了评估顺式双突变是否会增加脂质结合，他们使用含有阴离子脂质的脂质体在有或无0.1%的PIP2(生理浓度)的情况下进行脂质体沉降试验，评估不同突变体对PI3K的脂质结合的贡献。结果显示，E453Q/E545K、E453Q/H1047R、E545K/E726K、E726K/H1047R顺式双突变体与单突变体相比，其与阴离子和PIP2脂质体的结合增加。这部分实验结果说明了PIK3CA的顺式双突变通过削弱p110α与p85α的相互作用和促进膜结合来激活PI3K。

　　生化数据已经表明，PIK3CA顺式双突变增加了PI3Kα的活性。然而，PI3Kα抑制剂alpelisib中位抑制浓度(medianinhibitory concentration, IC50)值在重组的单突变和顺式双突变PIK3CA复合物中是相似的。类似的现象也出现在其他致癌基因中，WT和易位或突变蛋白在临床上接受相同的抑制剂浓度。因此，研究人员猜测顺式突变细胞是否对PI3Kα抑制剂表现出不同的敏感性。虽然在没有药理学压力的情况下，PIK3CA顺式双突变增加的的PI3Kα活性比单突变要高，但是，在使用PI3Kα抑制剂alpelisib处理后， MCF10A克隆中磷酸化的AKT和S6均受到相似的抑制。然后他们使用MCF10A细胞培养模型来检测PI3Kα抑制下的细胞生长。与次突变体或WT相比，E545K和H1047R主热点突变体对alpelisib更敏感。反过来，与单个主突变或次突变相比，所有顺式双突变对alpelisib的IC50、Emax和曲线下面积的敏感性都有显著提高。这些结果说明了，PIK3CA双突变提高了细胞对PI3K抑制剂的敏感性。

　　研究人员研究了转移性乳腺癌中PI3K抑制剂的临床反应与PIK3CA多突变的潜在相关性。他们在一项3期临床试验中对631例携带PIK3CA突变的乳腺癌患者进行测试，分别检测了PI3K抑制剂taselisib在有无fulvestrant联合用药情况下的临床疗效。这是迄今为止，在PIK3CA突变患者群体中测试PI3K抑制剂疗效的最大的随机临床研究。在631例试验患者中，598例有可供分析的血浆样本，其中508例足以进行检测。其中，339例患者检测到有PIK3CA突变，66例(19%)有两个或两个以上的PIK3CA突变。然后他们统计了PIK3CA突变患者在服用PI3Kα 抑制剂taselisib前后的治疗效果。结果显示，PIK3CA单突变患者服用taselisib(n = 80) 前的客观缓解率(objectiveresponse rate, ORR，定义为肿瘤缩小≥30%)值是10.0%，而服用taselisib(n = 193)后的ORR值是18.1%。PIK3CA双突变患者服用taselisib(n =23) 前的ORR值是8.7%，而服用taselisib(n = 43)后的ORR值是30.2%。这些发现进一步证实了最初的观察，与单突变肿瘤患者相比，多突变肿瘤患者可能从PI3Kα抑制中获得更高的临床获益。

　　总之，这篇研究表明，乳腺癌患者中PIK3CA顺式双突变通过过度激活PI3K通路从而增加致癌性，同时，对PI3Kα抑制剂的敏感性更大，从而可能从PI3Kα抑制治疗中获得更高的临床获益。PI3Kα抑制剂现在是PIK3CA突变的ER+转移性乳腺癌的标准治疗，并且正在其他PIK3CA突变的肿瘤组织学中进行探索。

　　原文链接：

　　https://science.sciencemag.org/content/366/6466/714

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