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RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术2

具体的实验步骤cDNA第一条链的合成：我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的 cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。注意： 在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。cDNA第二链的合成：第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。接头的连接及连接产物的稀释按照程序进行连接反应。如果没有对比样品和对照的产量，利用 Tricine－EDTA buffer制备接头连接的ds cDNA的......阅读全文