细胞和亚细胞提取物的制备实验9
实验方法原理差异去垢剂分离法（differential detergent fractionation, DDF) 包括使用一系列含不同去垢剂的 PIPES 缓冲液对细胞进行连续抽提，首先是毛地黄皂苷，其次是 Triton, 最后是 Tween/脱氧胆酸盐。这些步骤产生 4 种在生化和电泳上相异的组分 (见图 3.3 和表 3.7)。包括：1.胞质蛋白和可抽提的细胞骨架组分。用镁沉淀的方法可以从这个组分中初步纯化出微管组分（见本方案的附加方案：用镁沉淀微管蛋白和微管结合蛋白）。2.膜和细胞器蛋白。使用 TritonX-114 可以富集完整的膜蛋白（Bordier，1981;Pryde and Phillips,1996)。3.核膜蛋白和可抽提的核蛋白。4.抗去垢剂的细胞骨架纤维和核基质蛋白。骨架结合蛋白及其相互作用可进一步用不同浓度的脲来抽提、分析。此处所述的 DDF 方案改自分离 Madin-Darby 犬肾（Madin-Da......阅读全文
细胞和亚细胞提取物的制备实验9
实验方法原理差异去垢剂分离法（differential detergent fractionation, DDF) 包括使用一系列含不同去垢剂的 PIPES 缓冲液对细胞进行连续抽提，首先是毛地黄皂苷，其次是 Triton, 最后是 Tween/脱氧胆酸盐。这些步骤产生 4 种在生化和电泳上相异的组
细胞和亚细胞提取物的制备实验
方案1 哺乳动物组织的匀浆实验 方案2 用于免疫沉淀的培养细胞的裂解实验 方案3 用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解实验 方案4 氮舱减压法裂解培养细胞实验 方案5 细菌中重组蛋白的小量提取实验 方案6 细菌中重组蛋白的
细胞和亚细胞提取物的制备实验
实验方法原理 对于细胞内蛋白的纯化和特性分析，重要的是选择一种有效的方法来破碎细胞或组织，使蛋白迅速地从胞内相对隔离的空间中释放到缓冲液中，而该缓冲液应对所研究的蛋白的生物活性没有影响。广泛使用的破碎软组织的方法之一是勻浆。在本方案中，讨论了使用机械力匀浆组织：在 Potter-Elvehjem
细胞和亚细胞提取物的制备实验
从组织和细胞中提取蛋白可能是蛋白质组研究中最关键的一步，因为这一步影响了蛋白的产率、生物活性和特定目的蛋白结构的完整性。因此，我们要注意蛋白提取条件的选择。主要目标是在破坏力最小、保持蛋白结构完整性的前提下，可重复地使细胞最大程度地裂解。方案1 哺乳动物组织的匀浆实验实验方法原理对于细胞内蛋白的纯化
细胞和亚细胞提取物的制备实验3
方案3 用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解实验实验方法原理去垢剂裂解细胞法通常用于培养的动物细胞。典型的离子型去垢剂SDS(如2%SDS)能充分地裂解细胞。培养的动物细胞和细菌，如可以使用这种方式裂解。假如实验所用的抗体识别的抗原决定簇取决于自然空间构象，并对还原环境敏感，那么在裂解缓冲液
细胞和亚细胞提取物的制备实验2
方案2 用于免疫沉淀的培养细胞的裂解实验实验方法原理培养的动物细胞一般使用温和去垢剂来裂解。如果低浓度的去垢剂就能引起细胞的充分裂解（如 l%NP-40 或 l%Triton X-100)，那么这对目标蛋白的影响可能比方案 1 中所讨论的匀浆方法更温和。去垢剂的选择必须根据免疫沉淀所用的抗体的识别表
细胞和亚细胞提取物的制备实验8
方案8 酵母提取物的制备实验实验方法原理由于酵母的经典遗传分析和分子遗传分析都已经研究得非常透彻，因而对于纯化重组动物蛋白来说，酵母是一个很有吸引力的表达体系。关于培养和收集酵母细胞的讨论，尤其是芽殖酵母，参见 Jazwinski(1990)。酵母细胞的裂解方法有很多种，包括自溶、压力破碎（如 Fr
细胞和亚细胞提取物的制备实验7
方案7 从包含体中溶解大肠杆菌重组蛋白实验实验方法原理由于分子克隆技术能够使细菌高水平表达蛋白，因此原核表达是一个非常便利的获得重组蛋白的系统。遗憾的是这些蛋白在细菌中易于聚合和沉淀，形成难溶解的包含体，因而很难纯化。非细菌蛋白的包含体尤其普遍。虽然没有一种可用于所有蛋白的普适方法，还是有许多策略适
细胞和亚细胞提取物的制备实验4
方案4 氮舱减压法裂解培养细胞实验实验方法原理通过来自增压舱中的氮气减压膨胀来破碎细胞是一种快速、有效的细胞和组织的匀浆方法，能释放完整的细胞器和制备细胞膜（Hunter and Commerford，1961)。该方法的原理很简单：细胞放在一个压力舱中，在高压下（约5500kPa，相当于800ps
细胞和亚细胞提取物的制备实验6
方案6 细菌中重组蛋白的大量提取实验实验方法原理利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。适用于细菌细胞蛋白提取的方法包括超声波处理、玻璃珠研磨、钒土或石英砂研磨、French 加压罐高压剪切细胞和溶’菌酶处理。这些方法适用于从各种革兰阴性菌和革兰阳性菌中制备蛋白提取物。通常是使用酶的方法破坏细胞