1. 对于每组测序反应,标记四个0.5 ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2 ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20 μl)矿物油,盖上盖子保存于冰上或4℃备用。 2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂: (1) 样品反应: 质粒模板DNA :2.1 pmol 5×测序缓冲液 : 5 ml 引物: 4.5 pmol 无菌ddH2O 至终体积16 ml (2)对照反应 pGEM-3Zf(+)对照DNA(4 mg) :4.0 ml 5×测序缓冲液: 5 ml pUC/M13正向引物(4.5 pmol) :3.6 ml 3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0 ml测序级Taq DNA聚合酶(5 μ/ml)。用吸液器吸动几次混匀。 4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一个d/ddNTP混合物......阅读全文
1. 对于每组测序反应,标记四个0.5 ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2 ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20 μl)矿物油,盖上盖子保存于冰上或4℃备用。 2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂:
SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统,它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速,廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经90分钟就可读序,这是常规的放射性测序法做不到的。 此外,SILVER S
1. SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。 2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液(38%丙烯酰胺 W/V,2%甲叉双丙烯酰胺 W/V):95 g丙烯酰胺,5 g甲叉双丙烯酰胺溶于140 ml 双蒸水中,定容至250 ml,0.45 mm过滤器过滤后,贮于棕色瓶中,置于4℃冰箱
(1)测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入: 模板种类/长度 模板量 200 bp(PCR产物):16 ng(120 fmol) 3000~5 000 bp(超螺旋质粒DNA): 4 mg(2 pmol) 48 000 bp(λ,粘粒DNA): 1 mg(31 fmol) 由于超螺
实验方法原理 Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统,它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速,廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经90分钟就可读序,这是常规的放射
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子,大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板,凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶:将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘,用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品
1. 取0.2 ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂: 所加试剂 测定模板管 标准对照管 BigDye Mix 1 μl 1 μl 待测的质粒DNA 1 μl - pGEM-3Zf (+) 双链DNA - 1 μl 待测DNA的正向引物 1 μl - M13(
测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法,本系统的成败受几个因素的影响 ① 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR或Milli-QR的水)或双蒸水可获得较好的效果,如果水中有杂质,则低分子量条带可能无法出现。 ② 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的,美国化学学会级碳酸钠较好,如
3、质粒膜板制备:参照第一章所述的方法。 (二)超螺旋质粒DNA 的碱变性: 1、取4mg(约2pmol)超螺旋质粒DNA 至一eppendorf管中,加无离子水到终体积18ml。 2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液,置于室温(25℃下)保温5分钟。 3
pcr测序反应 (1) 取0.2ml的pcr管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂: 所加试剂 测定模板管 标准对照管 bigdye mix 1μl 1μl 待测的质粒dna 1μl - pgem-3zf (+) 双链dna - 1μl 待测dna的正向引物 1μl -