BioTechniques：从外周血中分离cfDNA的高通量方法

　　传统的ctDNA纯化方法首先要通过离心，从全血中分离出血浆，这一步妨碍了自动化的实施。为此，加拿大迈克•史密斯基因组科学中心的研究人员开发出一种方法，能够高通量地分离ctDNA。

　　在液体活检中，人们通常需要对游离的循环肿瘤DNA（ctDNA）进行分析。传统的ctDNA纯化方法首先要通过离心，从全血中分离出血浆，这一步妨碍了自动化的实施。为此，加拿大迈克•史密斯基因组科学中心的研究人员开发出一种方法，能够高通量地分离ctDNA。这项成果发表在《BioTechniques》二月刊上。

　　液体活检，这种新兴技术有望改变癌症检测和疾病监控。ctDNA是片段化的DNA，由癌细胞在凋亡或坏死过程中释放到血浆。通过检测ctDNA，医生有望发现癌症复发或转移的线索。目前，基于ctDNA的新一代测序检测已引入科研和临床实验室。

　　对于这些检测而言，第一步当然是纯化ctDNA。传统的方法需要先通过离心从全血中分离出血浆。不过，离心不仅是耗时费力的低通量过程，还容易引起样品污染和样品交换。为了突破这些限制，研究人员也在不断开发纯化新方法。

　　在这项研究中，迈克•史密斯基因组科学中心的Pawan K Pandoh及其同事开发出一种基于磁珠的自动化ctDNA分离方法，能够跳过离心从外周血中直接纯化ctDNA。他们将其称为“blood-direct”cfDNA分离法。

　　研究人员从七名癌症患者中分别采集了10 ml外周血。对于1-3号患者的样本，他们以2000 x g离心10分钟分离血浆，然后分成两份，以便比较QIAGEN的 QIAamp® Circulating Nucleic Acid kit和Bioo Scientific的NextPrep-Mag cfDNA Isolation Kit。4-7号患者的样本也同样分成两份，以比较NextPrep-Mag cfDNA方法和blood-direct分离方法（实验策略如下图）。

（图片来自原文）

　　blood-direct方法的具体操作如下。在磁珠存在时，在55°C的变性条件下用裂解结合缓冲液和蛋白酶K处理外周血15分钟。之后将混合物在室温下孵育1小时，期间每隔10分钟混合一次。通过磁力架捕获磁珠，然后加入洗脱缓冲液洗脱cfDNA。之后利用FTA试剂进一步纯化cfDNA。随后，他们开展文库制备和靶向富集，并在HiSeq 2500仪器上测序。

　　研究人员对四个病例的直接法和血浆法数据进行比较，发现等位基因检测的结果相当。在19个SNV中，血浆法发现了15个，而直接法发现了16个。并且，两种方法所得的cfDNA片段大小分布一致。这表明，从血液中直接分离ctDNA可作为一种替代方法，让整个流程自动化，从而提高实验通量。

　　研究人员认为，这种blood-direct磁珠方法既适合自动化，又适合低通量的手动处理，比如在没有实验室设备的现场护理时。“与Oxford Nanopore等第三代测序技术联用，cfDNA分析有望带来快速且经济的解决方案，不仅可检测低频率的突变，还可以检测甲基化状态及其他表观基因组的特征，”他们写道。