DNA复制时序对表观遗传信息及染色质高维结构的影响

　　Science |

　　在细胞周期的S期，基因组DNA按照时间先后顺序发生复制，DNA复制的时序被称为replication timing（RT）。RT是真核生物基因组的保守特征，与组蛋白翻译后修饰及染色质高维区室结构等表观遗传特征高度相关。RT是否能在细胞周期中维持染色质的某些结构及表观遗传特征尚不明确，回答以上问题需要在全基因组范围对RT进行干扰。此前已有研究发现敲降真核生物中保守的复制相关蛋白RIF1可以影响局部区域的RT。但RT的完全删除对表观遗传信息及染色质高维结构的影响尚未见报道。

　　2021年4月23日，来自美国Florida State University及Emory University等的多个研究团队合作，在Science上发表了标题为Replication timing maintains the global epigenetic state in human cells的研究论文，首次利用RIF1的敲除来研究RT的删除对细胞周期中染色质性状维持的影响。

　　作者首先在RIF1敲除的H9人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs），HCT116及HAP1细胞系中分别获得了高分辨率的Repli-seq图谱，以观察RIF1敲除在不同细胞类型中对全基因组范围的RT的影响。相较于其他两个细胞系，RIF1敲除的hESCs表现出最严重的RT紊乱，即早（E）和晚（L）的复制区混为一体，表明复制的时序性完全被打破。与之前报道的RIF1敲除细胞呈现的早晚复制区的交换现象不同的是，HCT116中敲除RIF1对早复制区的影响更大，而晚复制区基本不受影响。进一步研究发现，RT受影响的区域都富集RIF1，而RT不受影响的区域都缺少RIF1但富集抑制性组蛋白修饰H3K9me3的宽广区域（large domains），RIF1的敲除对这些区域的H3K9me3基本没有影响，而H3K9me3的敲降会让这些区域提前复制。

　　由于晚复制区通常处于转录抑制性的B区室，作者进一步采用Hi-C捕捉了全基因组的区室结构，发现RT不受干扰的晚复制区在WT中存在更强的远程相互作用，RIF1敲除后H3K9me3上调的程度和晚复制区相互间区室作用上调的程度成正比，暗示H3K9me3富集的晚复制区依赖区室而不是RIF1来维持其RT。相反，早复制区域相互间的区室化在RIF1敲除后变弱，其中的H3K27ac及H3K4me3的信号也变弱。以上发现表明RIF1敲除不仅会改变表观遗传信息，还会改变染色质高维结构。为进一步证明RIF1对以上因素的影响依赖DNA复制，作者采用细胞周期同步化手段将WT和RIF1敲降的细胞同步化到G1期，再将其释放到早、中、晚S期，通过Hi-C及ChIP-Seq比较染色质区室结构及组蛋白修饰在复制前后的变化。结果表明，RIF1敲降对染色质远程互作强度及H3K27ac、H3K9me3等表观遗传修饰的干扰均发生于S期。WT细胞中，早复制区及A区室相互间的染色质远程互作在S期早期上升随后下降，而敲降RIF1后以上远程互作在S期早期的上升趋势变弱，在S期中后期延迟下降。相反，晚复制区及B区室相互间的染色质远程互作在S期前期迅速下降并在S期的中后期小幅度恢复，而在敲降RIF1后以上远程互作在S期早期下降趋势变弱，在S期中后期上升趋势不够。以上变化都证实了RIF1对不同染色质区室结构的影响发生于DNA复制的不同阶段。类似的，RIF1敲降后活性增强子及启动子相关的H3K27ac修饰的丢失发生于S期的中后期，而转录抑制相关的H3K9me3修饰的丢失发生于S期的后期，表明RIF1对表观遗传修饰的影响也依赖DNA复制的过程。

　　为明确RIF1全敲引起的RT改变是一轮细胞周期的产物还是多轮细胞周期累积产生的效果，作者采用了AID可诱导降解RIF1的方式，检测RIF1降解24、48及96小时后（分别相当于1、2及4个细胞周期）RT、表观遗传修饰及染色质远程互作的变化特征。尽管RT在RIF1降解24小时即第一轮细胞周期时就达到RIF1全敲的效果，但是H3K27ac及H3K9me3等组蛋白修饰在RIF1降解96小时后仍未完全复制RIF1全敲的表型，且不受RIF1干扰的晚复制区相互间的远程互作在RIF1降解96小时后也未及RIF1全敲的效果。以上结果均表明RIF1全敲后RT紊乱导致的表观遗传修饰及染色质组装的错误是多轮细胞周期累积的产物。

　　Florida State University的David M. Gilbert教授是本文的通讯作者，博士研究生Kyle N. Klein、Peiyao A. Zhao及Emory University的博士后吕晓雯（Xiaowen Lyu，现任职厦门大学医学院）为本文的共同第一作者，Emory University的Victor Corces教授及University of Georgia的Stephen Dalton是本文的主要作者。