ELISA在生物大分子药物制剂分析上的作用

生物大分子药物是指分子量大于1000的生物活性分子，如多肽、蛋白质等。采用酶联免疫吸附法进行生物大分子药物制剂分析，可以对大分子抗原进行定量测定，对于生物大分子药物制剂的早期研究和开发作用巨大。

制剂中常含有赋形剂、稀释剂和附加剂，因此与原料药物不同。药物制剂分析指的是对不同剂型的药物，利用物理、化学，甚至微生物测定的方法进行分子检测，以检验被检查的制剂是否符合质量标准的规定要求。蛋白多肽类药物具有免疫原性，因此可以采用免疫分析法测定生物体液中的蛋白多肽类药物。常用的免疫分析方法有放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)等。而其中ELISA最为常用，具有灵敏度高、特异性强、高效、非放射性、重复性好、批量测定等优点。

与化学合成药物显著不同的是，生物大分子药物，(Biological，macromolecule，BMM)具有生物活性，多肤分子的活性与其一级结构相关，蛋白质分子的活性除取决于一级结构外，还与构象密切相关图。BMM的一级结构与构象往往呈现高度不稳定性，对温度、pH、有机溶剂耐受性差，易粘附在塑料和玻璃容器内壁，故要求分析条件比较温和；BMM是强效活性物质，干扰素纯化后可达2~8，x，108，u，/mg，而临床使用剂量低，所以要求分析方法灵敏度高；由于BMM制剂中往往须加入人与牛血清白蛋白(HSA、BSA)，以提高其稳定性，这样许多蛋白质总量测定法如Lowry法、双缩脉法就不能直接应用，而且BMM的降解产物的结构与母体很相似，这就要求分析方法特异性高。

ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。而且ELISA法免去放射性核素的污染，免疫反应后不需分离就可直接测定，灵敏度接近前者。由于酶与抗体都是大分子，二者结合常因位阻而导致活性高化，降低酶标结合物的作用，引人亲合素-生物素系统可以大大提高灵敏度。一个抗体分子可偶联多个生物素分子，而一个生物素分子仅与一个酶标亲合素结合，故可呈现放大效应。

ELISA的基本原理有3条：

（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；

（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；

（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此ELISA法是一种既敏感又特异的方法。

ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。

    ELISA试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以用于大分子药物制剂分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域。ELISA的影响因素较多，加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。免疫学方法的缺点是不能同时测定代谢物，具有抗原决定簇的代谢片段可能会增加实验结果误差；不同来源的抗体与相同的蛋白多肽反应可能有较大的差别；可能受到内源性物质的干扰。当免疫分析法与其他分离技术联用时可以解决某一缺点，用LC法结合RIA技术对胰高血糖激素类似肽(GLP)-2的体内外代谢物进行了分离及鉴定，解决了单独用RIA法导致的交叉免疫反应。