| 实验方法原理 | 多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55℃ 低温退火，引物与模板互补结合。在72℃条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种dNTP为原料，按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。所扩增的DNA可作为下一轮扩增反应的模板。重复上述循环过程，经过20～30个周期后，特异的目的DNA可扩增百万倍以上。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。 |
|---|---|
| 实验材料 | 血清样品 |
| 试剂、试剂盒 | HBV-PCR反应液 HBV-DNA裂解液 阳性模板 溴化乙锭 |
| 仪器、耗材 | PCR扩增仪 电泳仪 紫外线分析仪 |
| 实验步骤 |
一、标本处理 取混匀的血清20μl加20μl裂解液，搅匀后100℃沸水浴10分钟，最后15000rpm/min离心3分钟，取4μl上清待检。 二、加样及PCR 取反应液一管（使用前稍加离心），加4μl待检上清或阳性对照于底层反应液中，混匀后高速离心片刻，然后置PCR仪，设置程序94℃预变性2分钟，再按94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒扩增35个循环。 三、电泳与结果判断 取15μl 反应液，经2%琼脂糖凝胶电泳（5V/cm）30分钟后，在紫外灯下观察结果，若410bp处出现橙黄色带，则HBV为阳性。
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| 注意事项 |
1. 反应管中加好所有试剂后，应立即上机扩增，以免形成过多的二聚体。 2. 阳性模板可用阳性血清代替，处理方法同上。 3. 阳性模板及DNA提取液使用前需充分融化离心。 4. 反应也的表面为固体封盖剂，电泳取样时从反应管底部洗液。 5. EB为强致癌物，操作过程应注意防护。 6. 注意无菌操作，以免出现假阳性。
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