SD大鼠神经视网膜组织总蛋白质提取

实验概要

本实验提取SD大鼠神经视网膜组织总蛋白质，用Bradford法测样品蛋白浓度，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。

实验材料

经过分离和鉴定的SD大鼠神经视网膜组织

实验步骤

1. 神经视网膜组织总蛋白质提取

标本称重，置于研磨器中，液氮内研磨，按1:5( W/V)比例加入裂解缓冲液，涡旋震荡30秒，离心。4℃冰箱孵育1小时，期间每15分钟涡旋震荡1次，每次约30秒。40,000 g ( 4℃)高速离心60分钟。取上清PCR管分装，每管20 ul，-70℃冰箱保存。吸取1 ul，用Bradford法测样品蛋白浓度。

改进视网膜组织总蛋白质提取方法：

   1) 标本称重，置于Eppendorf(EP)管中，用研磨棒液氮内研磨。

   2) 按1:5 ( W/V)比例加入裂解缓冲液，涡旋震荡30秒，离心。

   3) 冰浴超声，200W X 6秒，间隔15秒，重复3次。

   4) 4℃冰箱孵育1小时，期间每15分钟涡旋震荡1次，每次约30秒。

   5) 40,000 g (4℃)高速离心60分钟。

   6) 吸取上清1ul用于蛋白浓度测定，其余分装，-70℃保存。

   7) Bradford法测样品蛋白浓度。

2. Bradford法测样品蛋白浓度

   1) 取Ep管12支，加样品管若干只。每个样品可设2个平行管，以求平均值。分两组编号；

   2) 分别在各Ep管中加入0.9% NaCl溶液；

   3) 分别在各Ep管中加入考马斯亮蓝溶液；

   4) 分别在各Ep管中加入1ug/ulBSA液；

   5) 充分涡旋振荡混匀；

   6) 3-20分钟内测吸光度(OD)值。用波长595nm，光径1 cm的微量比色法检测。将比色杯用去离子水冲洗干净，乙醇清洗后用滤纸吸干。用0号管调0。将比色杯中的液体倒入原管中，滤纸吸干比色杯的液体，依次由低浓度向高浓度进行，将各EP管中的溶液倒入比色杯，测定并记录各管OD值；

   7) 取OD值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，画出标准曲线；

   8) 用Excel求出标准方程：y(浓度)= ax (OD)十b；

   9) 代入样本OD值即可得到样品蛋白浓度(ug/ul)。(样品浓度最好为10 ug/ul)。

3. SDS-PACE

   1) 配胶

      a. 10%分离胶的配制(l0ml)

      b. 5%浓缩胶配制(5ml)

   2) 制胶

按配方配置分离胶和浓缩胶。取1 ml分离胶混合液，灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。凝胶完全聚合需30-60 min。将分离胶上的水倒去，加入浓缩胶混合液，立即将Teflon梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30 min。

   3) 上样

取冻存样品蛋白加入等体积2 x上样缓冲液，并将EP管放在微量恒温器100℃变性3-5分钟。在浓缩胶聚合完成后(30分钟)，小心拔下Teflon梳子，立即使用1 x SDS电泳缓冲液冲洗加样孔，以去除半聚合的丙烯酞胺单体，并以此缓冲液充满之。在电泳槽中加入电泳缓冲液至与玻璃上缘平齐，准备上样。用50ul平头加样注射器小心向加样孔中加样，每孔上样30ug。

   4) 电泳

将电泳装置与电源连接。用10 mA的恒定电流进行电泳。浓缩胶电压125V，直到溴酚蓝示踪染料进入分离胶。将电压调成225V(15 mA )，直至溴酚蓝到达分离胶的底部(约6h)。

   5) 染色

将胶从玻璃板中取出，置于平皿内，考马斯兰染色液染色，摇床缓慢震荡，室温4-6小时。

   6) 脱色

将胶从染色液中取出，用蒸馏水漂洗数次，放入脱色液中脱色至蛋白带清晰。

   7) 凝胶摄像和结果分析。