ScienceAdvances:扫描新技术探讨新冠病毒蛋白生物物理约束

提高SARS-CoV-2刺突蛋白(spike, S)的表达水平对于COVID-19疫苗的研发至关重要。之前的研究主要集中在设计受体结合结构域(RBD)和S2亚基，而氨基末端结构域(NTD)由于对其生物物理约束的理解有限而长期被忽视。2022 年11月23日，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校Nicholas C.Wu团队欧阳文浩、Timothy J.C.Tan等在SCIENCE ADVANCES期刊上发表了"Probing the biophysical constraints of SARS-CoV-2 spike N-terminal domain using deep mutational scanning" 研究文章，通过深度突变扫描定量分析了数千个NTD单突变对S蛋白表达的影响。结果表明，在S蛋白表达方面，NTD残基的突变耐受性与它们与RBD和S2的接近程度呈负相关。作者还发现结构域间界面的NTD突变增加了S蛋白的表达，但不改变其抗原性。这项研究不仅促进了对NTD生物物理限制的理解，而且为基于S蛋白的免疫原设计提供了宝贵的见解。

1 介绍

SARS-CoV-2的刺突蛋白(spike, S)在病毒侵入细胞时发挥了关键作用。S蛋白由S1亚基和S2亚基组成，S2亚基位于S蛋白C端，介导病毒-宿主膜的融合，S１亚基包含N端结构域（NTD）和受体结合域（RBD），RBD是与宿主受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合的关键区域，公认具有免疫优势，有研究表明NTD也是中和抗体的靶点，在免疫应答过程中发挥重要作用。结构研究表明，NTD上存在一个经常在SARS-CoV-2高关注变异株(VOCs)中发生突变的抗原超位点。在人类SARS-CoV-2进化过程中，氨基酸突变和插入缺失在NTD内迅速累积，至少部分原因是其免疫选择压力。另一方面，针对高关注变异株(VOCs)中保守的NTD表位的抗体也被发现。尽管NTD在对抗SARS-CoV-2的免疫应答中发挥重要作用，但对NTD的生物物理学约束在很大程度上仍不清楚。

COVID-19疫苗(包括基于重组蛋白和基于mRNA的疫苗)已被证明对SARS-CoV-2感染具有高度保护作用。高蛋白表达水平也被认为是mRNA疫苗有效性的关键。因此，识别增加S蛋白表达的突变对于优化COVID-19疫苗至关重要。目前大多数研究集中在突变S2亚单位和RBD以增加S蛋白的表达，由于对NTD的生物物理特性缺乏了解，很少有研究花费在NTD上。

通过深度突变扫描(将饱和突变和二代测序相结合)，可以大规模并行地测量许多突变的表型。之前的研究应用深度突变扫描来评估RBD突变对蛋白表达、ACE2结合亲和力和抗体逃逸的影响。虽然对RBD的深度突变扫描提供了关于免疫原设计和SARS-CoV-2进化的重要见解，但尚未开展关于S蛋白其他区域的类似研究。

在本研究中，作者使用深度突变扫描来量化数千个NTD单突变对S蛋白表达的影响。一个值得注意的观察是，与RBD残基不同，NTD残基显示出突变耐受性和相对溶剂可及性(RSA)之间的弱相关性。NTD残基的突变耐受性与它们与RBD和S2的距离强相关。残基S50和G232是两个例外，它们分别位于S2和RBD的近端，但具有较高的突变耐受性。并进一步对增加S蛋白表达的两个突变S50Q和G232E进行了功能特征分析。这些结果对理解NTD进化和基于S蛋白的免疫原设计具有重要意义。

2 结果

2.1 大多数NTD突变对S蛋白表达影响很小

为了研究NTD突变对SARS-CoV-2 S蛋白表达的影响，作者创建了一个突变体文库，其中包含了S蛋白第14 ~ 301位残基上所有可能的单氨基酸突变。在这288个氨基酸残基中，每一个残基都发生了突变，导致了一个包含5760个单氨基酸突变的突变文库。构建突变文库后，选取10个菌落进行Sanger测序作为质量控制。所有突变均为单一突变。

2.2 突变耐受性与溶剂可及性的相关性很小

首先，研究了突变耐受性与RSA之间是否存在相关性。由于埋藏残基对蛋白质折叠稳定性通常很重要，因此RSA较低的残基通常具有较低的突变耐受性。相反，NTD残基的突变耐受性与RSA的相关性较弱。这些观察表明，NTD的折叠稳定性对其突变耐受性和S蛋白表达水平没有强烈的影响。另一种可能是一些突变可以使NTD不稳定，但NTD不稳定并不影响S蛋白的表达水平。

2.3 突变耐受性与RBD/S2的距离相关

作者进一步计算了每个NTD残基到S蛋白RBD/S2的距离。突变耐受性与距离RBD/S2的距离呈正相关。NTD残基与RBD/S2的距离越远，突变耐受性越高。

2.4 自然循环的NTD插入缺失位点具有显著较高的突变耐受性

作者利用深度突变扫描数据分析了在17种SARS-CoV-2主要变异株中观察到的自然发生的NTD突变和插入缺失。

2.5 两个埋藏的NTD突变增加了S蛋白的表达

虽然毗邻RBD/S2的NTD残基通常具有较低的突变耐受性，但S50和G232是两个例外。例如，在作者的深度突变扫描结果中，突变S50G和G232E具有高表达评分。为了验证这一发现，使用相同的 landing pad 系统构建了稳定表达S50Q、G232E和S50Q/G232E双突变的HEK293T细胞株。通过流式细胞仪分析，与野生型(WT)相比，S50Q和G232E的平均荧光强度(MFI)分别增加了1.7倍(P = 0.002)和1.5倍(P = 9 × 10⁻⁴)，而S50Q/G232E增加了2.5倍(P = 2 × 10⁻⁶)。虽然MFI的倍数变化不太可能与蛋白质合成的倍数变化呈线性相关，但这种MFI的增加表明S50Q, G232E，以及S50Q/G232E双突变体相比WT的表面表达增加。

随后，作者研究了S50Q和G232E突变的自然发生情况。S50Q和S232E在流行的SARS-CoV-2中很少出现。在全球共享禽流感数据倡议(GISAID)的1000多万条NTD序列中，分别只有22条和3条序列包含S50Q和G232E。为了探究S50Q和G232E的结构影响，分析了它们的局部环境对S蛋白结构的影响，并使用Rosetta进行了结构建模。作者进一步重组表达了这些突变体，并使用热位移分析测试了它们的热稳定性。所有重组表达的S蛋白均含有S2亚单位的K986P/V987P突变，已知这些突变可稳定融合前构象并增加表达。WT和NTD突变体的变性温度几乎相同，Tm为46℃到46.5℃。这些观察表明，尽管S50Q和G232E都改善了NTD和S蛋白其余部分之间的相互作用，但它们对S蛋白的整体折叠稳定性影响很小。与野生型相比，所有突变体均提高了可溶性重组表达的S蛋白的产量。

2.6 S50Q和G232E对融合活性和抗原性影响较小

为了了解S50Q和G232E的功能结果，进一步测试与WT的比较，S50Q、G232E和S50Q/G232E是否表现出融合活性的变化。作者将表达人ACE2 (hACE2)和mNG2_1-10的HEK293T landing pad 细胞与表达S蛋白和mNG2₁₁的HEK293T landing pad 细胞混合。研究结果表明，S50Q和G232E均未影响S蛋白的融合能力。

然后，作者进一步研究S50Q、G232E和S50Q/G232E是否会改变S蛋白的抗原性。检测针对S蛋白不同结构域的3种抗体CC12.3(抗RBD)、S2M28(抗NTD)和COVA1-07(抗S2)的结合情况。其中，S2M28是一种NTD超位点靶向抗体。流式细胞仪分析表明，所有三种抗体均以与WT相似的水平与检测的突变体相结合，这表明S50Q、G232E和S50Q/G232E未改变S蛋白的结构构象和抗原性。

3 讨论

S蛋白是SARS-CoV-2进化和COVID-19疫苗研究的核心。虽然S蛋白上的RBD和NTD都是中和抗体的靶点，并且参与了SARS-CoV-2的抗原漂移，但NTD通常不像RBD那样受到关注。利用深度突变扫描，本研究表明许多NTD埋藏残基的突变并不影响S蛋白的表达。同时，NTD突变与RBD/S2越接近，越有可能损害S蛋白的表达。这些观察结果表明，对于最佳的S蛋白表达，NTD- RBD和NTD-S2界面的结构稳定性比NTD的折叠稳定性更关键。总之，这项研究为NTD的演变提供了至关重要的生物物理学见解。

NTD突变S50Q和G232E位于结构域间界面，增加了S蛋白的表达，这是本研究的另一个重要发现。改造高表达的S蛋白可以降低重组COVID-19疫苗的生产成本，并可能提高mRNA疫苗的有效性。与S2的某些先前特征突变相似，NTD中的S50Q和G232E在不改变Tm的情况下增加了S蛋白的表达量。同样，最近的一项研究表明，BA.1的NTD突变改善了S蛋白的表达，却不增加其热稳定性。此外，S50Q和G232E没有暴露在S蛋白表面，似乎没有改变S蛋白的抗原性。值得注意的是，根据作者的深度突变扫描数据，S50Q和G232E只是增强S蛋白表达的众多突变中的两个。因此，尽管大多数基于S蛋白免疫原设计的研究关注于RBD和S2的突变，但此研究的结果表明，NTD的突变可以提供一种互补的策略。

参考资料：

1. Ouyang WO*, Tan TJC*, Lei R, Song G, Kieffer C, Andrabi R, Matreyek KA, Wu NC. Probing the biophysical constraints of SARS-CoV-2 spike N-terminal domain using deep mutational scanning. Science Advances 8:eadd7221 (2022)