生化实验讲义(理论部分)三－－层析技术（二）
3.3 离子交换层析 3.3.1 简介 离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 3.3.2 基本原理 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基......阅读全文
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（十）
配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以了解其与基质的偶联情况，同时也可以推断亲和层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体的量来表示。测定配体结合量的方法很多，下面简单介绍几种：1) 差量分析：根据加入配体的总量减去配体与基质偶联后洗涤出来的量即可大致推
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（一）
通过生物化学实验应该做到： ⑴ 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 ⑵ 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器，包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、自动部分收集器、恒流泵、核酸蛋白检测仪、冰冻
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（二）
1.2 实验室规则 ⑴ 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理，写好实验预习报告，否则，不能进行实验。 ⑵ 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。 ⑶ 实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（九）
3.4.3 亲和吸附剂选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等等。这里主要介绍一些基本的原理，关于活化、偶联等过程的具体实验操作可以参阅本书后面的实验部分或相应的参考书。基质⑴ 基质的性质基质构成固定相的骨架，亲和层析的基质应该具有以
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（十一）
3.4.5 亲和层析的应用亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。抗原和抗体利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（八）
离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（meq / mg或meq / ml）来表示。通常可以由滴定法测定。阳离子交换剂首先用HCl处理，使其平衡离子为H?。再用水洗至中性，对于强酸型离子交换剂，用NaCl充分置换出H?，再用标准浓度的NaOH滴定生成的HCl，
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（六）
5. 洗脱速度洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（四）
5. 正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说，分离纯化
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（七）
3.3 离子交换层析3.3.1 简介离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换
生化实验讲义(理论部分)——层析技术（五）
柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。 2. 分配