定量PCR实验技术分享
1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右，一般有什么方法解决？ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。2. 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带，而内参用同样体系就没有呢?引物被污染。3. 实时定量PCR，荧光定量PCR，实时荧光定量PCR，real－time PCR，这些是不是同一个概念是一个概念。4. 我的标准曲线的slope总是大于４，而且每个梯度的平行ct值差别比较大，原因？这个斜率是＝1/LOG 10(扩增效率)，理论上扩增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理？酶活是否正常？平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范......阅读全文
如何做好荧光定量PCR实验
荧光定量PCR实验指南一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从
实时荧光定量PCR具体实验步骤
1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚仿相，中间层以及无色水相上
实时荧光定量PCR具体实验步骤
1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相
相对－RTPCR:－样品定量实验
已知线性范围的循环参数和 18SrRNA 引物与竞争子的比例，就可以用自己的样品去做相对定量 RT-PCR。下面配制的 PCR 反应混合物包含 9 个反应（4 个样品、4 个非反转录对照、1 个不加模板的对照）及 10% 的额外份额。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂
相对－RTPCR:－样品定量实验
试剂、试剂盒 双蒸水RT-PCR 缓冲液MMLV 逆转录酶SUPERaseINRNA 酶抑制剂 Taq DNA 聚合酶总 RNA 随机引物dNTP 混合物 基因特异的正向引物基因特异的反向引物[a-32P]dCTP仪器、耗材 Quantu mRNA Universal 18S standards P
相对－RTPCR:－样品定量实验
试剂、试剂盒 双蒸水 RT-PCR 缓冲液 MMLV 逆转录酶 SUPERaseINRNA 酶抑制剂 Taq DNA 聚合酶 总 RNA
普通PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR技术的功能区别
一、普通PCR技术 KARY MULLIS （1944.12.28-2019.8.7） Kary Mullis于1983年发明了聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction ，PCR），据说是载着女友开车的时候，忽然灵光一闪，想到了PCR原理（论开车的好处）
荧光定量PCR技术原理及利用
荧光定量PCR技术是在PCR技术的基础上发展而来的，PCR技术是由人创造的模拟基因组DNA自然条件下的复制的一项技术。我们都知道，基因组要完成复制才能发生细胞的分裂；如果基因组不能复制，那么随着细胞的分裂，基因组会被逐渐稀释。正是由于基因组的半保留复制，才使得物种的繁衍得到生生不息。正如上所述，基因
实时荧光定量pcr仪技术原理
所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的
荧光定量PCR技术及其应用（二）
3 应用由于FQ-PCR具有高灵敏性，高特异性和高精确性的特点，目前，该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。3.1 病原体测定由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要
实时荧光定量PCR的技术原理
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。常规
实时荧光定量PCR的技术概况
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
荧光定量PCR技术及其应用（一）
荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简
实时荧光定量PCR的技术原理
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增
定量PCR技术常见问题交流
1. 如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右，一般有什么方法解决没有 ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。 解决办法可以将模
荧光定量PCR技术及其应用（一）
荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简
概述荧光定量PCR技术的原理
又称实时PCR技术。该技术在常规PCR基础上，添加了一条标有两个荧光基团的荧光双标记探针，一个标记在探针的5′端称为报告基团(Reporter，R)；另一个标记在探针的3′端称为荧光抑制基团或称淬灭基团(Quencher，Q)。两者可构成能量传递结构，即5′端R发出的荧光信号可被3′端R基团抑制。3
实时荧光定量PCR技术的应用
1. 基因工程研究领域 ① 基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。 ② 转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因
定量PCR
定量PCR可以用于：（1）以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量；（2）用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。实验方法原理定量PCR（即时聚
定量PCR
实验方法原理 定量PCR（即时聚合酶链锁反应，Real-time Polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time
使用实时定量－PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术（一）
采用通过监测产物积累进行的实时反转录聚合酶链式反应（ RT － PCR ）可以用来验证基因表达的差异。我们在此报道了一种基于 SYBR Green I 染料进行的实时 PCR 定量方法并通过产物的融解曲线来确定在基因表达谱方法中确定的基因表达差异的重复性。因为 SYBR Green I
使用实时定量－PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术（二）
实时 RT-PCR 与 DNA 阵列结果的比较G3PDH 是在大多数细胞中表达的含量丰富的看家基因，但在某些条件下的表达发生改变（ 11 ），通过 DNA 阵列杂交发现， G3PDH 的转录本在亚克隆 20863 和 20861 中的表达相同。实时定量 RT-PCR 也发现在两个亚克隆中有着
知晓PCR，定量PCR与数字PCR的实验方法与选择
从1985年至今的30多年时间里，PCR分析经历了三代技术的发展。一代传统PCR技术，采用琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR产物进行定性分析。第二代荧光定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控PCR进程，最后用Cq值对基因进行定量分析。第三代数字PCR技术，通过将PC
如何做好荧光定量PCR实验？（六）
其他问题：1）、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。2）、在实验之前要进行哪些准备工作？首
荧光定量PCR实验中的扩增对照
通常说的阳性对照和阴性对照指的是扩增试剂盒中附带的不需要提取的阳性对照和阴性对照，更准确的定义应该是扩增阳性对照和扩增阴性对照。扩增阳性对照含有阳性扩增模板，扩增阴性对照应含有阴性扩增模板（基质核酸）。扩增对照只能监控每次扩增过程中的扩增系统是否正常，不能监控采样、提取和每份样品的操作过程。如果是检
如何做好荧光定量PCR实验？（一）
荧光定量PCR实验指南一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键： 1、 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从h
实时荧光定量PCR具体实验步骤（一）
1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色
实时荧光定量PCR原理和实验（一）
无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到P
如何做好荧光定量PCR实验？（二）
2.4 实时多重PCR探针的选择：多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用不同的染料标记探针，在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物。另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的目的片段，反应中加入SYBRN染料，最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。多重实时PCR的荧光探
如何做好荧光定量PCR实验？（三）
3.3 引物、探针的纯度和稳定性定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都