含有RecA的目标片段经T4DNA聚合酶处理后的SLIC亚克隆
实验概要SLIC(Sequence and Ligation Independent Cloning)是一种不依赖于基因序列和连接反应的高效基因克隆新方法，它可以实现体外同源重组反应中多个DNA片段在单一反应中的装配和单链的退火。实验步骤1．用限制性内切酶处理2微克载体，使用QIAEX II凝胶提取试剂盒纯化载体并分离DNA，对载体进行定量。2．使用Taq DNA聚合酶扩增片段，设立100μL 的PCR反应体系：250μM dNTP ，0.5 μM 引物和 2.5 U Taq DNA聚合酶(Eppendorf公司)。周期如下：94°C 45秒，(94°C 45秒，54°C 45秒，72°C 1分钟，30周期)； 72°C 10分钟，PCR扩增后加入20U Dpnl 至100μL PCR产物，37°C孵育1小时(不是必要的，如果从MAGIC载体至ColE1来源)。通过QIAquick......阅读全文
核酸扩增—普通聚合酶链反应
把DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物由5'到3'扩增延长，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA增加1倍，新合成的DNA链又可作为下一个循环的模板，经过30-50个循环，可使原DNA量增加
T4－DNA聚合酶实验
T4 DNA聚合酶 实验材料 DNA 试剂、试剂盒
沉淀－σ32－和－RNA－聚合酶实验
试剂、试剂盒 聚乙烯亚胺仪器、耗材 SDS-PAGE 电泳装置聚丙烯酰胺小胶实验步骤 材料与设备SDS-PAGE 电泳装置聚丙烯酰胺小胶（10%)试剂聚乙烯亚胺（PEI)(6% 储液，pH7.9)(配方，见“试剂的配制”，pp.184~189)操作程序1)0.2%DOC 上清 (见 p.153)
耐热DNA聚合酶的选择指南
一、耐热DNA聚合酶特点合理选择耐热DNA聚合酶是PCR成败与否的一个关键因素，如何选择最合适的耐热聚合酶，是进行PCR实验首先要考虑的问题。目前市面上有许多耐热 DNA聚合酶，虽然名称各不相同，但主要区别在于特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度等几个指标。TIANGEN公司生产的耐热DN
聚合酶链反应的反应特点
特异性强PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模
聚合酶链反应PCR反应体系
PCR是20世纪80年代由美国西特斯公司的一批科学家、技术人员和商人发明的，主要发明者凯利·穆利斯（Kary Mullis）因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。其他科学家和技术人员，包括厄立克（Henry Erlieh）、安海姆（Norman Arnheim）、才木（Ran—daliSaiki）、霍
沉淀－σ32－和－RNA－聚合酶实验
试剂、试剂盒聚乙烯亚胺仪器、耗材SDS-PAGE 电泳装置聚丙烯酰胺小胶实验步骤材料与设备SDS-PAGE 电泳装置聚丙烯酰胺小胶（10%)试剂聚乙烯亚胺（PEI)(6% 储液，pH7.9)(配方，见“试剂的配制”，pp.184~189)操作程序1)0.2%DOC 上清 (见 p.153), 取 6
聚合酶链反应的控制方式
PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/LTaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L反应温度和循环次数变性温度和时间 95℃，3
关于DNA聚合酶的历史简介
在50年代的中期，A. Kornberg和他的同事们就想到DNA的复制必然是一种酶的催化作用，于是决心分离出这种酶并研究其结构和作用机制。为了达到这个目的，他们分离的蛋白，然后加到体外合成系统中即 同位素标记的dNTP、Mg2+及模板DNA，经过大量的工作，于1956年终于发现了DNA聚合酶Ⅰ（
RNA聚合酶的基本信息
RNA聚合酶（RNA polymerase）是以一条DNA链或RNA为模板，三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶，因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
RNA聚合酶Ⅱ的基本转录因子
RNA聚合酶Ⅱ的基本转录因子转录因子分子量(kD)功能TBP30与TATA盒结合TFⅡ-B33介导RNA聚合酶Ⅱ的结合TFⅡ-F30,74解旋酶TFⅡ-E34,37ATP酶TFⅡ-H62,89解旋酶TFⅡ-A12,19,35稳定TFⅡ-D的结合TFⅡ-I120促进TFⅡ-D的结合
RNA聚合酶的基本信息
RNA聚合酶（RNA polymerase）是以一条DNA链或RNA为模板，三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶，因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
修复聚合酶的基本信息
中文名称修复聚合酶英文名称repair polymerase定 义参与DNA修复过程，依赖于DNA的DNA聚合酶。该酶以双链DNA中未损坏的链为模板，合成新片段置换因损坏而被切除的片段。应用学科生物化学与分子生物学（一级学科），酶（二级学科）
逆转录聚合酶链反应
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得
聚合酶链反应的污染来源
1、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。2、PCR试剂的污染：主要是由于在PCR
PCR技术（三）：Taq－DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的.(一)酶活性与热稳定性 该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比
逆转录聚合酶链反应
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得
DNA聚合酶作用部位及功能
DNA聚合酶作用部位是磷酸二酯键。1、聚合作用：在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令，即A与T，C与G的配对原则，逐步逐个、连续地将dNTP加到延伸中的DNA分子3'-OH末端，逐步合成延长中的子链DNA。这是DNA聚合酶的主要作用；2、3’→5’'外切酶活
聚合酶链反应构建重组DNA
实验材料 DNA试剂、试剂盒 TE无水乙醇DNA聚合酶CTP仪器、耗材 电泳仪离心机PCR仪实验步骤 1. 制备模板DNA，如DNA不是经氯化铯梯度纯化的，100℃煮沸10 min 以灭活核酸酶。 2. 制备寡核苷酸引物，若PCR产物要进行平端克隆，就应该对引物的5’端羟基进行磷酸化处理。 图一
T4－DNA聚合酶实验
T4 DNA 聚合酶具依赖人为模板的聚合酶活性，同时具有对单链、双链DNA的3’到5’端的外切酶活性，缺少5’到3’端的外切酶活性。实验材料DNA试剂、试剂盒Trish·CldNTPMgCl2BSADTT仪器、耗材水浴锅实验步骤一、50 μl 反应体积：（1）50 mmol/l Tris·Cl，p
RNA聚合酶的基本信息
RNA聚合酶（RNA polymerase）是以一条DNA链或RNA为模板，三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶，因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
聚合酶链式反应（PCR）
PCR技术可用于：（1）检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态；（2）有效检测癌基因的突变，准确检测癌基因的表达量；（3）临床应用于检测地中海贫血的基因突变。实验方法原理基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
关于聚合酶链反应的概述
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点。 PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-
聚合酶链反应的基本步骤
主要分为三大步骤:高温变性、低温退火、适温延伸。分别添加引物、模板、Taq酶、dNTP和缓冲液等反应物混合,在约为95℃环境下,双链DNA氢键断裂解旋为单链;单链与人工设计的引物在约为60℃温度下,按照碱基互补配对的原则相结合;并升温到72℃左右,利用Taq酶延伸合成一条新的与模板DNA链互补的半保
T4－DNA聚合酶实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 Trish·CldNTPMgCl2BSADTT仪器、耗材 水浴锅实验步骤 一、50 μl 反应体积：（1）50 mmol/l Tris·Cl，pH8.0（2）5 mmol/l MgCl2（3）5mmol/l DTT（4）100 μmol/l 4dNTP混合液（5
原位聚合酶链式反应和原位反转录聚合酶链式反应操作
（一）、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪。 （二）、操作流程 1、原位PCR步骤 1）预处理： （1）切片常规脱蜡； （2）0.2mol/L HCl处理10min； （3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；
原位聚合酶链式反应原位反转录聚合酶链式反应操作规程
（一）、仪器设备 英国 Thermo Hybaid 原位 PCR 仪。 （二）、操作流程 1 、原位 PCR 步骤 1 ）预处理： （ 1 ）切片常规脱蜡； （ 2 ） 0.2mol/L HCl 处理 10min ； （ 3 ） 5 μ
原位聚合酶链式反应原位反转录聚合酶链式反应操作规程
（一）、 仪器 设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪。 （二）、操作流程 1、原位PCR步骤 1）预处理： （1）切片常规脱蜡； （2）0.2mol/L HCl处理10min； （3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min； （4）Nase消化组织37℃ 30min； （5）梯度酒
Pfu－DNA聚合酶的基本信息
中文名称Pfu DNA聚合酶英文名称Pfu DNA polymerase定 义存在于嗜热古菌(Pyrococcus furiosus) 的耐热DNA聚合酶，兼具5′→3′DNA聚合酶活性及3′→5′外切酶活性。应用学科生物化学与分子生物学（一级学科），酶（二级学科）
聚合酶链式反应（PCR）实验
PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是ssDNA片段。待扩增DNA模版加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。此时，两引物的3'端相对，5'向背。在合适的