甲基化特异性PCR全程易出现的问题与控制措施
一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下：(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3．0～3．9 mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5．0；(2)修饰时间应掌握在10～16 h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；(3)反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)；(4)DNA模板量应控制在<2ug为宜。只要遵循以上几点基本上能保证99％ 未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA有约96％已经降解 。当DNA样品较少时(如石蜡包埋组织、血清D......阅读全文
PCR实验指导与常见问题分析2
Fig. 11. Example of the influence of extension temperature. Multiplex PCR with mixtrues A-B using two different PCR programs. Reactions on the right s
PCR实验指导与常见问题分析5
MgCl2 concentrationRelationship between MgCl2 and dNTP concentrationdNTP concentrations of about 200µM each are usually recommended for the Taq polyme
PCR实验指导与常见问题分析7
11. All products in my multiplex reaction are weak. How can I improve the yield?Decrease annealing time in small steps (2º C)Decrease extension temper
PCR技术（五）：常见问题分析与对策
PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模
PCR实验指导与常见问题分析6
Non-denaturing PAA gelsTo separate PCR products differing in only a few bp in length (for example, microsatellite markers), 6-10% PAA gels need to be
PCR实验指导与常见问题分析4
Fig. 25. Multiplex PCR of mixtures A-D comparing PCR programs with 2 (green) and 1 (yellow) minute extension time at 54° C annealing temperature. Comp
PCR实验指导与常见问题分析1
CONTENTPCR guide: a discussion of the main parameters influencing the outcome of the PCR and multiplex PCR reaction in 16 pages/sections and using ove
dna甲基化与rna甲基化的区别
DNA甲基化和组蛋白修饰的相同点：都有包含甲基化修饰；不同点：修饰对象不同，一个是对DNA修饰，一个是对蛋白：组蛋白修饰。而RNA干扰是对RNA的降解，与前两者差异较大。
PCR产物回收试剂盒可能出现问题及解决方法
1. 无DNADNA Wash Buffer没有用无水乙醇稀释；2. 低DNA产量样品中加入的Binding Buffer的量太少；请按照使用说明加入足够量的Binding Buffer；若DNA片段长度小于200bp，可加入6倍体积的Binding Buffer；若DNA片段长度大于4kb，则加入
易被忽视的仪器日常维护问题
任何仪器，无论其设计制造技术如何先进、完善，在使用过程中都免不了因各种原因而产生这样或那样的故障，只是仪器的故障率不同而已。为保证仪器的正常工作，对仪器进行日常维护和及时修理是极其重要和不容忽视的。然而，有很多仪器都是因为日常维护保养工作不到位，而造成仪器故障，严重的甚至提前报废。这不仅会
尿酸高－3种并发症易出现
痛风 尽管高尿酸并不一定会导致痛风，但是痛风患者都有高尿酸症。 肾病 尿酸过高时，肾脏的排泄压力会增加，长此以往，肾脏就会受损，而尿酸含量过高，也会增加急性肾衰竭的发病风险。 图片 心脏病 高尿酸血症是心血管疾病的危险因子之一。尿中的酸性物质含量过高，会在体内形成尿酸盐结晶，在动脉血
易初莲花猪骨头熬汤出现汞珠
“太可怕了，骨头里怎么会有水银呢?”昨日，68岁的曹老太说，最近，她从位于省体育中心的易初莲花超市买了一些猪骨头，用来煮汤喝。4月5日，在喝骨头汤时，她突然发现骨头缝里和表面有水银。超市方面称，因他们手头没有购物小票，此事难以处理。 骨头中竟发现“汞珠” 昨天上午，记者来到了曹
增加PCR特异性的方法有哪些
预测一下扩增产物，在NCBI做一个primer blast如果需要设计定量PCR引物，可以在“引物库”中直接搜索，不用查找序列，设计引物，选择参数，确定引物等，输入基因名，直接提供引物序列，并进行非特异性检测
等位基因特异性PCR的应用
由于PCR过程中引物延伸是3'端开始的，所以3'末端的碱基对引物的延伸来说处于至关重要的位置。如果这个碱基与模板互补，则引物能从不间断延伸，PCR可以正常进行，得到特定长度扩增带。反之，则不能延伸。所以只要将与正常等位基因所不同的那个突变碱基安排在引物3'最末端，当用某一含突
等位基因特异性PCR的原理
等位基因特异性PCR（ allele specific PCR，AS-PCR ），是指利用引物与模板之间的碱基错配可以有效地抑制PCR反应，进而达到模板区分（等位基因区分）的目的。
基于PCR评估sgRNA特异性的方法
CRISPR/Cas9已经成为一种通用的基因组工程工具，依赖于一个单导向RNA（sgRNA）和Cas9酶进行基因组编辑。研究人员可以用简单、快速和经济的方法来产生sgRNAs，因此能够在培养细胞、小鼠、斑马鱼和其他模型系统中进行靶向诱变。为了靶向效率，预先筛选sgRNAs，对于成功诱变和减少动物
等位基因特异性PCR的功能
等位基因特异性PCR（ allele specific PCR，AS-PCR ），是指利用引物与模板之间的碱基错配可以有效地抑制PCR反应，进而达到模板区分（等位基因区分）的目的。
PCR反应的特异性决定因素
①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度
隐血试验的特异性问题
为解决隐血试验的特异性问题及鉴别消化道出血部位，当前发展的最快的是免疫学方法，如免疫单扩法、对泫免疫电泳、酶联免疫吸附试验、免疫斑点法、胶乳免疫化学凝聚沦，放射免疫扩散法、反向间接血凝法、胶体金标记夹心免疫检验法等，此类试验所用抗体分为两大类，一种为抗人血红蛋白抗体，加一种抗人红细胞基质抗体。免疫学
热电偶检定易忽视问题
一、热电偶的长度 JJG351-1996《工作用廉金属热电偶》检定规程中明确规定热电偶长度不小于750mm，之所以对长度作出规定，是因为考虑到热电偶在离开测温区后要有足够宽的温度梯度区。热电偶的热电动势也就产生在这一区域，要有效地阻止热电偶热端(测量端)的热量传给冷端(接线端)，最基本的方法就是热
数字PCR在甲基化含量鉴定的应用
作为表观遗传学研究中重要的一个研究方向——甲基化程度分析，现阶段有不同的方法或技术来进行研究：如传统的亚硫酸氢盐处理后的克隆测序法、抗体检测法、定量PCR检测法等受限于方法学的问题，不能获得甲基化程度的精确定量，而数字PCR系统通过对样品的微液滴处理及目标分子的绝对拷贝数定量，为甲基化程度的精确定量
如何增加RTPCR特异性？
起始cDNA合成 第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆
数字PCR技术在DNA甲基化检测中的应用
DNA甲基化是目前研究最多的表观遗传修饰之一，发生于CpG二核苷酸序列C5位置的胞嘧啶上，多发生于CpG岛上，研究发现，DNA甲基化参与调节多种细胞过程，包括胚胎发育，转录，X染色体失活，基因组印迹、染色体稳定性等。许多研究发现，DNA甲基化在一系列的疾病（如癌症等）起到十分重要的作用。在癌症患者中
PCR常见的问题总结
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些zui好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有: ①模板核酸的制备; ②引物的质量与特异性; ③酶的质量及活性; ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板： ①模板中
PCR扩增后没有出现条带
没有条带说明没有PCR产物，应该是PCR阶段原料准备处理线遗漏，建议回忆一下实验过程，重新制备
PCR扩增后没有出现条带
没有条带说明没有PCR产物，应该是PCR阶段原料准备处理线遗漏，建议回忆一下实验过程，重新制备
如何提高荧光定量PCR检测实验反应的灵敏度与特异性？
(1)确定模板RNA完整性，无DNA污染。(2)RNA模板中不应含有扩增反应的抑制剂。(3)为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。(4)使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。(5)若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩
PCR疑难问题粉碎机：逆转录PCR的操作要点与方法
逆转录 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一种以 RNA 为样本，RNA链被逆转录成为互补 DNA（cDNA），再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。在实际应用中，RT-PCR 分为一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR。
血浆中ctDNA甲基化数字PCR检测攻略Naica数字PCR的应用
基因调控区的DNA甲基化状态的改变可导致多种癌症的发生。这种表观遗传学改变在生物学上是稳定的，并存在于循环肿瘤DNA（ctDNA）中，使其适合于早期检测和无创动态监测肿瘤负荷。数字PCR技术凭借其较高的灵敏度、精准度以及对抑制剂的耐受度，在对低拷贝样品检测时表现出了极大的优势。在转移性和II/III
提高RTPCR特异性的方法总结
第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位