质粒构建之酶切位点的选择
结论：一定要选择具有相同buffer的两个酶 技术背景： 克隆目的基因，并把其装入表达载体转化/转染原核细胞/真核细胞中，是获取目的蛋白/研究基因功能的经典方法，也是目前科研工作者常用的方法。其中酶切是该技术不可缺少的一部分，随着载体设计技术的发展，双酶切以其独特的优点而逐渐取代了单酶切 。 具体实验流程如下： 设计合成含有酶切位点，能扩增基因ORF全长的一对引物——PCR扩增目的基因——纯化PCR产物——分别对PCR产物及载体进行双酶切——分别纯化双酶切产物——连接目的基因与载体——转化大肠杆菌——筛选阳性克隆——质粒提取——转化/转染——获得重组蛋白/功能研究 酶切反应虽然是在PCR之后，但是酶的选择却是在PCR前引物设计时就完成了。我觉得这就是错误的根源！ 故事：导师给我的第一个课题就是研究病毒包膜蛋白的功能，首先我需要克隆出该基因，并把它装入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组质粒。根据pcDNA3.1(+)载......阅读全文
限制[性酶切]位点的定义和应用
中文名称限制[性酶切]位点英文名称restriction site定 义限制性内切酶在DNA双链上所识别的一些特殊序列。在分子生物学和基因工程中常用的Ⅱ型限制性内切酶识别的多为4、6或8对核苷酸的双链回文序列。应用学科生物化学与分子生物学（一级学科），方法与技术（二级学科）
限制[性酶切]位点保护试验的方法和应用
中文名称限制[性酶切]位点保护试验英文名称restriction site protection experiment定 义当一段DNA被某些蛋白质(如转录因子、组蛋白等)结合后，这段DNA上的限制性酶切位点就不会被相应的限制性酶切开。因此将待研究的DNA与蛋白质一起保温，再用该DNA链上已知的限
位点特异性核酸内切酶的蛋白质工程实验
实验材料 pMQ402试剂、试剂盒 阿拉伯糖苯甲基磺酰氟Ni-NTA 琼脂糖结合缓冲液清洗缓冲液洗脱缓冲液透析缓冲液仪器、耗材 超声破碎器冷冻离心机实验步骤 3. 方法此处列出的方法概括了为定点突变而做的氨基酸位点选择（见 3.1)、为在细菌细胞中表达而做的 MutH 蛋白突变 （ 见 3.2 )
位点特异性核酸内切酶的蛋白质工程实验
实验材料pMQ402试剂、试剂盒阿拉伯糖苯甲基磺酰氟Ni-NTA 琼脂糖结合缓冲液清洗缓冲液洗脱缓冲液透析缓冲液仪器、耗材超声破碎器冷冻离心机实验步骤3. 方法此处列出的方法概括了为定点突变而做的氨基酸位点选择（见 3.1)、为在细菌细胞中表达而做的 MutH 蛋白突变 （ 见 3.2 ) 和 Mu
位点特异性核酸内切酶的蛋白质工程实验
位点特异性核酸内切酶的蛋白质工程 实验材料 pMQ402 试剂、试剂盒
酶的活性位点的作用
酶的活性位点通常是蛋白质表面一个能够让底物结合和嵌入的凹陷或裂隙，底物通常通过不同的相互反应结合位点上与现存的氨基酸结合，如：氢键、离子键、范德华力相互作用或偶极-偶极相互作用。例如，底物可能通过氢键结合在丝氨酸残基上，也可通过离子键结合在天冬氨酸残基上，或通过范德华力结合在苯丙氨酸残基上。这些结合
酶的活性位点的定义
酶的活性位点通常是蛋白质表面一个能够让底物结合和嵌入的凹陷或裂隙，底物通常通过不同的相互反应结合位点上与现存的氨基酸结合，如：氢键、离子键、范德华力相互作用或偶极-偶极相互作用。例如，底物可能通过氢键结合在丝氨酸残基上，也可通过离子键结合在天冬氨酸残基上，或通过范德华力结合在苯丙氨酸残基上。这些结合
DNA－酶－I－超敏感位点作图
DNA 酶 I 超敏感位点作图法经常用于定位真核基因的调控区。由于还未被理解的原因，基因带有对 DNA 酶 I 切割敏感的分开的序列，而且这些所谓超敏感位点图谱是随基因的激活状态而变化的（Weintrauband Gmudine1976)。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J.
DNA－酶－I－超敏感位点作图
实验材料 真核细胞 试剂、试剂盒 缓冲液 A EDTA 乙醇 裂解缓冲液
DNA－酶－I－超敏感位点作图
实验材料 真核细胞试剂、试剂盒 缓冲液 AEDTA乙醇裂解缓冲液磷酸盐缓冲液台盼蓝染料DNA 酶 I 稀释缓冲液DNA 酶 I 溶液蛋白酶 K 溶液RNA 酶溶液酚：氯仿SDS 缓冲液TE仪器、耗材 Sorvall H1000B 转头或等价物带螺帽的试管振荡水浴锅实验步骤 材料缓冲液和溶液贮存液、缓
凝血酶切割位点的定义
中文名称凝血酶切割位点英文名称thrombin cleavage site定 义基因工程表达系统中融合蛋白常用的连接序列，凝血酶处理可将融合蛋白中目的蛋白与非目的蛋白的肽段分离，最适切割位点是：P4-P3-P2-Arg↓-P1′-P2′，式中P4和P3为疏水氨基酸，P1′和P2′为非酸性氨基酸，↓
蛋白酶的分类及作用位点
蛋白酶分类作用位点已知抑制物氨基肽酶金属蛋白酶带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、·D或·Q组成的肽键2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉菠萝蛋白酶巯基蛋白酶无特异性α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化羧肽酶A锌金属蛋白酶带有自由氨基酸的L—氨基酸羧基端；不能分解R、P或羟脯氨酸
蛋白酶的分类及作用位点
蛋白酶分类作用位点已知抑制物氨基肽酶金属蛋白酶带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、·D或·Q组成的肽键2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉菠萝蛋白酶巯基蛋白酶无特异性α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化羧肽酶A锌金属蛋白酶带有自由氨基酸的L—氨基酸羧基端；不能分解R、P或羟脯氨
DNA酶切
一、 DNA酶切反应 1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在
DNA酶切
一、 DNA酶切反应 1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶
DNA的酶切与连接——质粒DNA酶切
DNA的连接和酶切可用于：（1）利用限制性核酸内切酶切割DNA和利用DNA连接酶连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一；（2）成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效的实验材料。实验方法原理限制性内切酶能够特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附
识别位点
中文名称识别位点英文名称recognition site定 义限制性内切酶特异结合的核苷酸序列。应用学科细胞生物学（一级学科），细胞遗传（二级学科）
剪接位点
中文名称剪接位点英文名称splicing site;splice site定 义剪接体可识别的RNA前体中内含子和外显子连接边界的序列和接头位点。根据位置不同可以分为供体和接纳体剪接位点。应用学科生物化学与分子生物学（一级学科），基因表达与调控（二级学科）
生物酶学基础蛋白酶的分类及作用位点
蛋白酶分类作用位点已知抑制物氨基肽酶金属蛋白酶带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、·D或·Q组成的肽键2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉菠萝蛋白酶巯基蛋白酶无特异性α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化羧肽酶A锌金属蛋白酶带有自由氨基酸的L—氨基酸羧基端；不能分解R、P或羟脯氨酸
切刻内切酶（NEAR）恒温扩增
切刻内切酶（NEAR）恒温扩增是目前相关研究最少的一种恒温核酸扩增技术。它是在2008年由Ionian科技公司的研究人员开发并申请ZL的（Brain等2009）。除了链置换酶（Bst）外，NEAR反应中还需添加一个切刻内切酶。NEAR反应的引物设计需要将所使用的切刻内切酶的DNA作为序列加在引物
内切酶列表：
Single letter code:R = G or A; Y = C or T; W = A or T; M = A or C; K = G or T; S = C or G;H = A, C or T;V = A, C or G;B = C, G or T;D = A, G or T;N =
DNA酶切反应
一、 DNA 酶切反应1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管
酶切反应心得
一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用
【共享】双酶切
1、 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。2、 回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol
双酶切反应
双酶切buffer的选择： 1、U ：Supplied with its own unique reaction buffer that is different from the four standard NEBuffers. Its compatibility with the fou
酶切反应建议
一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶
DNA的限制性内切酶酶切反应
[实验目的] 通过本实验学习DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验技术。 [实验原理] 1.限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作
限制性内切酶酶切反应实验原理
限制性内切酶已有百余种，每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性，酶的活性需Mg2+来激活。不同的酶也有许多差别：有些酶除需Mg2+外，还需ATP等其他辅助因子的激活；切割位点和识别序列间的距离不同；某些内切酶同时具有甲基化作用。根据这些差别，可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅱ型限制性内切酶只需要
酶切的基础知识（酶切原理和实验过程）
酶切的原理：DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点
进入位点
中文名称进入位点英文名称entry site定 义特指氨酰tRNA进入核糖体的部位。应用学科生物化学与分子生物学（一级学科），核酸与基因（二级学科）