重组酶聚合酶扩增（RPA）技术简介
核酸检测革命：可替代PCR的犀利技术——RPA重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。RPA原理介绍重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个......阅读全文
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的问题对策介绍
所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。基因扩增技术—聚合酶链反应实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。 1、假阴性 出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不
酶促重组等温扩增（ERA）的原理和核心技术
酶促重组等温扩增技术(ERA技术)是一种等温核酸扩增技术,它是利用抗体制药领域先进的Molecular Design、Directed Evolution、Affinity Maturation 等技术手段,将来源于细菌,病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能,通过不同的核酸扩增反应体系进
恒温核酸扩增技术通量
在实际的产业化中，分子诊断仪器的通量往往至关重要。对于qPCR而言，由于引物设计的成熟和荧光通道的多样性，往往可以比较好的实现高通量检测。由于恒温核酸扩增技术引物设计较为困难，单一的反应温度会造成引物和模板，引物与引物之间的非特异性链接和扩增，使得恒温扩增的检测通量受到限制。但同时也得益于反应温
等温扩增技术的原理及应用
等温扩增技术（isothermal amplification technology，ITA）是近年来发展起来的基于恒温扩增的新型核酸扩增技术,主要包括环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[1]、交叉引物扩增（crossing pr
总结篇：一图全面总结各种等温PCR关键要素
乘着新冠的东方，PCR被广泛关注，PCR中的等温PCR由于其系统对仪器设备需求低也备受瞩目，对于医疗设施相对较差地区，甚至可以不需要仪器，只需要一个恒温水浴锅即可。等温扩增PCR发展至今已经近30年，目前市面是的等温PCR七七八八数起来也有大约15种，其中有些工作原理相似或相同，先前也逐个进行了介绍
恒温核酸扩增技术的扩增速度
由于恒温核酸扩增只需要在一个温度下进行，相比较于PCR不同温度之间的循环，恒温扩增不需要反复的升温降温过程，有些恒温扩增的速度是快于PCR的扩增速度的。例如：环介导恒温核酸扩增（LAMP），重组聚合酶扩增法（RPA）以及切刻内切酶恒温扩增（NEAR）。目前英国公司optigene已经成功的改造了
RNA酶保护试验((RNase－Protection－Assay,RPA)简介
RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。1。原理：双链RNA（杂交的）能够抵抗RNA酶的降解。2。应用：检测RNA表达3。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1．
RNA酶保护实验(RNase－Protection－Assay,RPA)简介
简介：RNA酶保护试验(RNase Protection Assay，RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。1. 原理：双链RNA（杂交的）能够抵抗RNA酶的降解。2. 应用：检测RNA表达3. 与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优
RNA酶保护实验(RNase－Protection－Assay,RPA)简介
简介： RNA酶保护试验(RNase Protection Assay，RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。 1. 原理：双链RNA（杂交的）能够抵抗RNA酶的降解。 2. 应用：检测RNA表达 3. 与Northern杂交和RT-PCR比较
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的凝胶电泳介绍
基因扩增技术—聚合酶链反应产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以前者最常用，通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中，仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解，稍冷后倒入电泳槽。 电泳后，用溴化乙淀染色20mi
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的点杂交的介绍
当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的特异性介绍
首次报导的基因扩增技术—聚合酶链反应所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年Saiki等从温
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的缓冲液介绍
基因扩增技术—聚合酶链反应反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20m
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的操作程序介绍
过去标准的基因扩增技术—聚合酶链反应操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下： （1）向一微量离心管中依次加入 DNA模板 102-105拷贝 引物 各1μmol/L dNTP 各200μmol/L 10×PCR缓冲液
恒温核酸扩增反应引物探针设计问题合集
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司开发）。以此为基础的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全
研究提出基于有源数字微流控的核酸绝对定量新方法
传染病防控是公共卫生领域面临的重要挑战。由于病毒感染性疾病临床表现多样、传播途径复杂，因此发展准确、灵敏的病毒检测技术至关重要。目前，主流的数字核酸绝对定量方法如数字PCR、数字RPA，存在操作繁琐、人工依赖度高、耗时长等问题，难以满足应对传染病快速变化的现实需求。近日，中国科学院苏州生物医学工程技
聚合酶链反应的扩增平坡概述
扩增反应并不是可以无穷地进行下去的，经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进入平坡；进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.3～1pmol时，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。造成PCR
聚合酶链式反应（PCR）扩增和扩增产物克隆
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤：(1) 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过
聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
第一节 概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃
聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上
耐热DNA聚合酶简介
耐热DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶)：1969年人们从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离出一种嗜热的水生真菌Thermusaquaticus,能在70~ 75C生长,从该菌分离纯化得到一种耐热的、依赖DNA 的DNA 聚合酶,简称Taq DNA 聚合酶。 耐热DNA聚合酶是一种可抗高温
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的条件模板核酸的介绍
基因扩增技术—聚合酶链反应可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴
关于基因扩增技术—聚合酶链反应的微孔板夹心的介绍
基因扩增技术—聚合酶链反应是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交，漂洗后显色即可判断结果，该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV
PCR、qPCR、dPCR你需要知道的事儿
上世纪八十年代Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，如今DNA扩增俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，PCR技术在不断
PCR、qPCR、dPCR你需要知道的事儿
上世纪八十年代Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，如今DNA扩增俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，PCR技术在不断蜕变却从
等温扩增到底行不行？
最近又看到一些同行写的关于等温扩增的文章。不禁想起几年前看到的RPA技术介绍。当时第一次看到这个技术的时候，简直可以用“震惊”、“惊艳”来形容。扩增速度真快啊，十几分钟就能出结果，比现在吭哧吭哧做PCR岂不是方便多了！可是几年过去了，似乎也没看到基于RPA技术的临床产品上市。说真的是有点失望的。就像
RPA技术原理与RPA产品形态简述
回顾2019年，RPA机器人流程自动化行业迎来了一个快速发展的机遇。RPA创业者得到了国内投资人的认可，一些RPA公司也接连拿到千万美金级别的融资，这在当下遇冷的资本市场环境下显得格外耀眼。 眼下，RPA已在金融、财会、电信、能源、制造、物流等行业领域生根发芽。当下的RPA技术可以替代各行业企
聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆（四）
[注意]1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。 2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。四、载体加dT尾1、将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。 2、在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。 3、加入1μl(
聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆（一）
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤：(1) 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目
聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆（三）
材料、设备及试剂一、材料不同来源的模板DNA。二、设备移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。三、试剂：1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl， 100mmol/L Tris·Cl， 在25℃下， pH9.