用TaqDNA聚合酶进行双脱氧测序反应实验
试剂、试剂盒 去离子蒸馏水ddNTPdNTP甲酰胺加样缓冲液。酶和缓冲液。Taq 酶或类似的热稳定 DNA 聚合酶Taq 酶稀释缓冲液核酸和寡核苷酸寡核苷酸引物模板 DNA(100ug ul) 溶于 TE 中放射性化合物5'32P 标记的寡核苷酸引物仪器、耗材 微量离心管（0.5 ml) 或微量滴定板装有多孔加热板的程控热循环仪可加热到 65°C 的水浴实验步骤 材料缓冲液和溶液试剂、缓冲液、储液的组成参见附录 1, 储液使用前稀释到适当浓度。去离子蒸馏水（冰预冷）ddNTP,4 种 ddNTP 储液（5 mmoI/L)dNTP,4 种 dNTP 储液（lmmol/L)甲酰胺加样缓冲液10x 标记混合液和 ddNTP 延伸/终止混合液当测序模板富含二級结构时，用等摩尔 7-脱氨-2'-dGTP 代替 10X 标记混合液和 ddNTP 延伸/终止混合液中的 dGTP。酶和缓冲液5x 反应缓冲液200 mmol/LT......阅读全文
上样并进行－DNA－测序实验
试剂、试剂盒 缓冲液和溶液 0.5XTBE 和 或 1XTBE 凝胶 核酸和寡核苷酸 仪器、耗材
上样并进行－DNA－测序实验
DNA 序列可通过酶解或化学降解产生一系列成套的 DNA 片段，这些片段可以通过薄层变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分辨。一个典型的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能够分辨出编码 15~400 个核苷酸长度的 DNA 序 列。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔
PCR测序方法你知道几种？（二）
(2)测序引物同位素标记测序引物:用[yP]ATP或[γP]ATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5末端进行同位素标记。引物浓度:0.1~0.2mmol/L非同位素标记测序引物:用荧光标记4种双脱氧核苷酸,可以进行以荧光为基础的双脱氧测序反应。 (3)DNA聚合酶应为无3→5外切活性的耐热DNA聚合酶。
Taq－DNA聚合酶（with－MgCl2－in－Buffer）使用说明
『注意事项』1. 长期储存（非频繁使用）于-70ºC；每天或每周使用储存于-20ºC。尽量避免多次冻融，勿暴露在温度波动较大之处，这些波动对产品的稳定性有一定影响。2. 建议在100l反应液中，酶的使用量为1~2.5l。过多酶量和过长的延伸时间可能会引起非特异扩增条带。3. 为
分子生物学常用实验技术（十五）
第十章测序技术 在分子生物学研究中，DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger 等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam 和Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随
DNA序列测定技术
DNA序列测定技术序列测定的技术和策略Sanger双脱氧链终止法Maxam－Gilbert DNA化学降解法测序策略目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干
DNA测序技术（非同位素银染测序系统操作技术与T7－DNA...4
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录，则可用EDF胶片保留实验结果。[注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败
DNA序列测定技术
DNA序列测定技术序列测定的技术和策略Sanger双脱氧链终止法Maxam－Gilbert DNA化学降解法测序策略 目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的
DNA测序技术（非同位素银染测序系统操作技术与T7－DNA...7
在分子生物学研究中，DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基
DNA聚合酶及DNA连接酶的功能和区别
DNA聚合酶，以已有的核酸序列作为模板，将4种脱氧核苷酸（A、T、G、C）按照模板的碱基排列顺序，以“碱基互补原则”依次连接，聚合成为一条新的DNA链。 DNA连接酶，是将DNA片段上的缺刻连接起来的酶。 一、DNA聚合酶 （一）DNA聚合酶I DNA聚合酶I（DNA pol
PCR测序方法详细介绍
直接测序法 一、原理 PCR扩增获得双链DNA产物经变性形成单链,测序引物与其中一条模板链上的互补序列退火。退火的引物在低进行性反应条件下(如低温和低dNTP浓度),通过DNA聚合酶催化作用延伸20——80个核苷酸;由于此反应体系中掺入放射性标记的dNTP,能使新合成的DNA链中含有多个
DNA测序PCR测序反应
1. 取0.2 ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂： 所加试剂 测定模板管 标准对照管 BigDye Mix 1 μl 1 μl 待测的质粒DNA 1 μl － pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1 μl 待测DNA的正向引物 1 μl － M13(
PCR技术反应五要素是什么？
1、引物PCR 反应成功扩增的一个关键条件是正确设计寡核苷酸引物。引物设计一般遵循以下原则:①引物长度:一般为15～30bp,常用为 20bp 左右,引物太短,就可能同非靶序列杂交,得到不需要的扩增产物。②引物扩增跨度:以200～500bp 为宜,特定条件下可扩增至10kb。③引物碱基:G+C 含量
DNA序列测定的技术和策略
目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱
蛋白质DNA相互作用的甲基化和尿嘧啶干扰分析法—尿喀啶
实验方法原理在尿嘧啶干扰实验中，探针是在TTP和dUTP混合物存在下用PCR扩增而产生，因此产物中的胸腺嘧啶残基被脱氧尿嘧啶取代（羟基取代了胸腺嘧啶的5- 甲基)。尿嘧啶碱基可被尿嘧啶-N-葡萄糖基化酶特异性切割，产生对哌啶敏感的脱嘧啶位点。实验材料含有蛋白质结合位点的DNA试剂、试剂盒针对结合位点
DNA重组（DNA－recombination）技术：DNA序列测定1
㈣ DNA聚合酶 如前所述，选用合适的DNA聚合酶进行测序反应也是保证测序质量的重要因素之一。常用于双脱氧末端终止法测序的有几种不同的酶： 1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 此酶是最早用于建立Sanger测序的酶。但通常会有两个问题：①Klenow片段的持续合成能力较
【回顾】一代、二代、三代测序技术
第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后
DNA测序——非同位素银染
实验方法原理Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到
DNA测序的方法非同位素银染色法的原理
SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外，SILVER SEQ
非同位素银染测序系统操作技术
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外
DNA测序非同位素银染色法
SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外，SILVER S
DNA(脱氧核糖核酸)测序
DNA测序是确定特定DNA片段的核苷酸顺序的过程。到目前为止，大多数的DNA测序都是使用弗雷德里克·桑格开发的链终止方法进行的。这种技术利用修饰的核苷酸底物通过序列特异性终止DNA的合成反应。然而，新的测序技术，如焦磷酸测序正在获得越来越多的测序市场份额。焦磷酸测序比桑格DNA测序产生了更多的基
目的基因的PCR克隆的原理（一）
1实验原理 1.1聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理
DNA测序仪pcr测序反应
pcr测序反应 (1) 取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂： 所加试剂 测定模板管 标准对照管 bigdye mix 1μl 1μl 待测的质粒dna 1μl － pgem-3zf (+) 双链dna － 1μl 待测dna的正向引物 1μl －
激活的热稳定－DNA－聚合酶进行反转录和－DNA－扩增实验
试剂、试剂盒 RNA寡核苷酸引物 脱氧核苷三磷酸 RT RNA PCR 酶 AccuRT 缓冲液 UNG 琼脂糖 溴化乙锭
激活的热稳定－DNA－聚合酶进行反转录和－DNA－扩增实验
试剂、试剂盒 RNA寡核苷酸引物脱氧核苷三磷酸RT RNA PCR 酶AccuRT 缓冲液UNG琼脂糖溴化乙锭二甲基亚砜乙酸镁去除 RNA 酶的水SYBRGreen I Dye仪器、耗材 琼脂糖凝胶的电泳设备实验步骤 一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂琼脂糖二甲基亚砜（见注释 1)(DMSO)溴化乙锭
激活的热稳定－DNA－聚合酶进行反转录和－DNA－扩增实验
本实验介绍激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。试剂、试剂盒RNA寡核苷酸引物脱氧核苷三磷酸RT RNA PCR 酶AccuRT 缓冲液UNG琼脂糖溴化乙锭二甲基亚砜乙酸镁去除 RNA 酶的水SYBRGreen I Dy
用大肠杆菌－DNA－聚合酶－I－Klenow－片段及单链－DNA－模板进行...
用大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段及单链 DNA 模板进行双脱氧测序实验试剂、试剂盒 dATP去离子蒸馏水EDTA延伸 终止混合液和示踪混合液甲酰胺上样缓冲液Tris-Cl酶和缓冲液大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKienow 片段核酸和寡聚核苷酸寡核苷酸引物单链 DNA 模板放射性化合物
影响PCR的主要因素（温度循环参数、引物设计与DNA聚合...3
4．RTth逆转录酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆转录-PCR（RT-PCR）的发展很快，所以对耐热的依赖于RNA的DNA多聚酶的研究也有进展。有实验表明Taq DNA多聚酶有依赖于RNA的DNA聚合酶活性，但活性较弱。Cetus公司于1991年推出一种rTt
PCR实验技术（一）
PCR（聚合酶链式反应）【原理】PCR（polymerase chain reaction）用于在体外将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。反应体系：①样品DNA；②引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约15-20个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区之间的区域；③4种d