稳定转染:从G418浓度确定到单克隆化鉴定2
c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可隆了呀；d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。我的建议：1、在100mm dish中挑克隆，细胞分的稀一点。2、把细胞全部消化下来，在96孔板中逐步稀释获得单克隆。2、问题2.筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表达量高且能稳定表达的，不大容易。这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。3、问题3.细胞形态的改变：稳定转染后阳性克隆均出现不同程度的细胞形态的改变。想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。不过，我转的是一种抑癌基因。4、问题4.单克隆化的时机和个数：加药筛选时， 一般等到确认的转染细胞长到70%以上时，再做有限稀......阅读全文
稳定转染:从G418浓度确定到单克隆化鉴定2
c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可隆了呀；d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。我的建议：1、在100mm dish中挑克隆，细胞分的稀一点。2、把细胞全部消化下来，在96孔
稳定转染:从G418浓度确定到单克隆化鉴定1
一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为 0.722g。2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细
稳定转染:从G418浓度确定到单克隆化鉴定3
5、方法5.关于稳转的方法，好像园子里很多研究者都用的是有限稀释法来作，但是我们实验室基本上都不用九十六孔做有限稀释来作单克隆的，一般的做法都是这样：1.3.5cm皿铺细胞，长到大概80％以上的时候作转染。2.转染后一天消化，传到一个大皿（1：6）或者两个大皿（1：12）。3.再过一天后加入带G41
从G418筛选，转染到单克隆化的总结
我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722
G418筛选稳定表达细胞系
1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。3.制备筛选培养基：在100ug/ml~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100
G418筛选稳定表达细胞系PROTOCOL
1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个10
真核转染
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而
更换细胞系之后需要重新验证敲低效率吗
基因敲出质粒转染可以构建稳定细胞株一种是脂质体转染后,单克隆筛选稳定细胞株.另外一种是应用逆转录病毒,慢病毒转染,筛选稳定细胞株.脂质体转染：在转染24小时后,消化细胞并计数.将细胞种到96孔板,保证每个孔2-3个细胞,这样才能得到单克隆.待细胞贴壁后,加入抗生素筛选.筛选时间和浓度视细胞而定.一般
人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验
人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立：（1）探讨肺癌远处转移和阻断其远处转移的研究；（2）模拟晚期非小细胞肺癌转移的自然发生过程；（3）在活体动物的完整器官内评估瘤细胞播散和肿瘤的生长。实验方法原理将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549，G418筛选获得稳定表达GFP
从RNA抽提到电泳鉴定2
逆转录（RT）一，准备工作1， 实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）EP 管1.5ml、100ul（4）水浴箱2，实验器具的处理与准备塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37
质粒转染大肠杆菌
质粒转染大肠杆菌可应用于：（1）细菌株的构建；（2）细胞工程；实验方法原理感受态细胞易于接受外来基因成为重组细胞，实验将质粒加入有感受态细胞的培养皿中，热击处理进行质粒转染。实验材料细胞株质粒试剂、试剂盒链霉素青霉素FCSPBS胰酶EDTA转染试剂(Lipofectamine TM2000)胰化蛋白
质粒转染大肠杆菌
实验方法原理 感受态细胞易于接受外来基因成为重组细胞，实验将质粒加入有感受态细胞的培养皿中，热击处理进行质粒转染。 实验材料 细胞株 质
从航天可视化到可视化航天
自9月28日进入北京航天飞行控制中心，在历时12天的紧张工作中，石家庄铁道大学校信息科学与技术学院院长赵正旭教授及刘展威、佟宽章、王威4人圆满地完成了嫦娥二号三维可视化前期任务。向全球展现了嫦娥二号发射任务的实时精彩仿真。 “以前是航天可视化，现在是可视化航天。”北京航天飞行控制中心
人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验
实验方法原理 将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549，G418筛选获得稳定表达GFP细胞，对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死。HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。利用KODAK IS2000MM系统检测肿瘤播散情况。实验材
CHO细胞的稳定转染与基因表达
1、pcDNA3.1＋-gD的线性化: pcDNA3.1＋使用说明书推荐了以下几个酶作为线性化酶(BglⅡ MfeⅡ Bst1107Ⅰ Eam1105Ⅰ PvuⅠ ScaⅠ SspⅠ),通过DNAMAN分析gD序列发现其带有MfeⅡ酶切位点。2、转染前一天,在60mm的dish中接种8×105个细胞
稳定细胞株构建
稳转细胞系（稳定表达细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。稳转细胞株包括多克隆稳转细胞株和单克隆稳转细胞株。慢病毒感染目的细胞后，通过抗性基因筛选得到的细胞株是多个细胞克隆的组合。单克隆细胞株是从多克隆细
Sox2：从转录因子到免疫卫士
近日著名的免疫学杂志《自然免疫》发表了中科院生物物理所关于转录因子Sox2在固有免疫中的重要作用：Sox2在中性粒细胞中能够充当胞内DNA传感器的作用，当Sox2结合了细菌DNA后，Sox2会通过激酶TAK1和转接蛋白TAB2介导下游信号通路，开始转录翻译一系列的促炎因子。 检测到细胞中的外源
电穿孔法稳定转染
实验材料L8057-Y10细胞D-PBSA仪器、耗材培养瓶培养板F12 FB培养基G418(Invitrogen)选择性培养基电穿孔电穿孔专用杯电穿孔仪II电穿孔仪-II配套的效能扩增器-Plus实验步骤表达载体与 DNA 制备：pSVTKGH，线性化 [ Selden et al.，1986]此载
电穿孔法稳定转染
方案27.12 脂质体介导的瞬时转染 实验材料 L8057-Y10细胞 D-PBSA
电穿孔法稳定转染
实验材料 L8057-Y10细胞 D-PBSA 仪器、耗材 培养瓶 培养板
丹纳赫生命科学细胞株开发整体解决方案
目前，丹纳赫生命科学包括IDT、贝克曼库尔特生命科学、美谷分子、SCIEX、艾杰尔-飞诺美、徕卡显微系统、颇尔等七家公司，为食品安全、环境保护、法医检测、 临床检查等应用市场客户提供先进的产品、技术和解决方案；为蛋白质、生物药和化学药物等分析提供创新的技术和分析诊断工具；为生命科学研究的客户
基因转染和实验设计原则
磷酸钙-DNA共沉淀法核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项
G418
G418通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成G418 G418是一种氨基糖苷类抗生素 ,这种氨基糖类抗生素的结构和新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和
从ChatGPT看“从0到1”和“从1到100”
■吕乃基 转眼间，OpenAI发布ChatGPT已经一年多，但围绕其展开的话题仍然很“热”。 “从0到1”和“从1到100”是近年来常见于媒体的表述，前者指原始创新，后者意为原始创新落到实处并在各领域得到广泛应用。然而，究竟何为“1”？OpenAI发布ChatGPT前后的过程，其主线即“从0
从ChatGPT看“从0到1”和“从1到100”
转眼间，OpenAI发布ChatGPT已经一年多，但围绕其展开的话题仍然很“热”。 “从0到1”和“从1到100”是近年来常见于媒体的表述，前者指原始创新，后者意为原始创新落到实处并在各领域得到广泛应用。然而，究竟何为“1”？OpenAI发布ChatGPT前后的过程，其主线即“从0到100”，
稳定表达细胞株的建立
1、将转染后的细胞按照一定的比例接种到6孔板中（一般选用1：10和1：100两个梯度），分别采用1200mg/ml，1000mg/ml和800mg/ml的G418进行筛选；以转染携带EGFP质粒载体的细胞作为阳性对照，以未转染质粒载体的细胞作为阴性对照；2、每3～4天换液一次；3、筛选20～30天，
G418筛选慢病毒感染稳定细胞株
用慢病毒筛选稳定细胞株，以G418筛选方法为例，筛选出稳定整合Neomycin抗性基因的细胞系。A、 G418抗生素最优浓度筛选 每种细胞对抗生素的敏感性不同，因此，准备建立稳定细胞系之前，需要确定能够在10-14天杀死细胞的最佳浓度。方法如下：1、将细胞稀释到1000个细胞/mL，接种到24孔板，
转染细胞的稳定筛选实验
实验方法原理 外源基因转染真核细胞后整合入基因组DNA，能够长期存在于细胞中，随染色体复制而传给子代。外源基因进入培养细胞一般要经过几天才能够整合入基因组DNA。 实验材料
转染细胞的稳定筛选实验
实验材料 转染细胞试剂、试剂盒 抗生素培养基胰酶仪器、耗材 6孔板24孔板96孔板CO2培养箱滤纸片培养瓶实验步骤 1．确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。1) 提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细
干细胞稳定转染操作步骤
外源基因进入细胞主要有三种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法，实际上其基本原理都是利用不同的方法在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入，但是由于前两者的效率低且伤害较大，所以现在除了对于一些特殊细胞系，一般的转染方法都利用脂质体。利用脂质体转染和其他方法一样，最重要的就是防治其毒性，因此脂质体与