为什么质粒酵母电转化不进去
酿酒酵母的电转感受态制备方法和电转化方法(1)接种工业酒精酵母至30 mL液体YEPD培养基，30度培养12 h；(2)取培养物以1%的接种量转接到30 mL新鲜YEPD液体培养基中，30度培养8 h，使菌体达到同步生长状态；(3)将酵母培养物置于冰上放置30 min后，6,000 r/min离心5 min收集菌体；(4)弃上清，加入已预冷的15 mL超纯水洗涤菌体一次；(5)6,000 r/min离心5 min收集菌体，用15 mL 1 mol/L山梨醇重复洗涤菌体三次；(6)离心收集菌体，加入200μL 1 mol/L山梨醇重悬浮菌体，取200μL的菌悬液至1.5 mL离心管中；(7)在制得的菌悬液中加入20μL(≤5μg)待转化的质粒或DNA片段，轻轻混匀后冰浴10 min；(8)将冰浴后的菌悬液转入已预冷的电转杯中，1,500 V电击5 ms；(9)加入适量体积的1 mol/L山梨醇将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，取20......阅读全文
为什么质粒酵母电转化不进去
酿酒酵母的电转感受态制备方法和电转化方法(1)接种工业酒精酵母至30 mL液体YEPD培养基，30度培养12 h；(2)取培养物以1%的接种量转接到30 mL新鲜YEPD液体培养基中，30度培养8 h，使菌体达到同步生长状态；(3)将酵母培养物置于冰上放置30 min后，6,000 r/min离心5
毕赤酵母电转化
实验概要本实验介绍了毕赤酵母电转化方法。该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。与去壁细胞效率相似。实验步骤1. 细胞准备： 1) 在含5mlYPD 的50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜。 2) 取0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含500ml 新鲜培养基的2L
重组质粒的电转化法
首先，将0.1cm的电击杯放在冰上进行预冷，冻存的感受态细胞取出冰上溶解。2然后，用100微升的感受态细胞加入1微升纯化的连接液，或者加入0.5微升未纯化的连接液，小心混匀，在冰上放置二十分钟。3然后，将混合液加入预冷的电击杯中，注意擦干杯外的水，防止电火花，放入电转化仪的反应槽内，接上电源。4然后
质粒太大转染转不进去怎么办
更换质粒、优化转化条件、使用不同类型的转化方法、检查菌种状态。1、更换质粒。质粒本身太大的问题导致转不进去，可以尝试更换另一种质粒，以确保其质量和兼容性。2、优化转化条件。转化条件如质粒浓度、农杆菌菌液浓度、转化时间、转化温度等，都可能影响转化效果。可以尝试调整这些条件，以优化转化过程。3、使用不同
质粒DNA导入细菌细胞实验——电转化法
实验方法原理高压电转化简单，快捷可靠，而且是目前效率最高的质粒DNA转化大肠杆菌方法。不过该方法需要电转化装置。实验材料菌落试剂、试剂盒LB甘油SOC仪器、耗材平板离心瓶聚丙烯管电阻器电转化池实验步骤1. 接种一个单菌落于5 ml LB培养液，37°C温和振摇培养5 h或过夜。2. 将2.5 m
质粒的酵母直接转化
实验方法原理将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒；将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母；再将文库质粒转化到酵母中实验材料单菌落试剂、试剂盒PLATE溶液载体DNA转化质粒DNA仪器、耗材离心管离心机实验步骤1、 用牙签从平板中挑取单菌
酵母质粒载体的特点
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体(shuttlevector)。在基因工程中，应用上述病毒表达载体在哺乳动物细胞中进行中、小规模的表达是十分实际的。还要有对组织培养技术十分熟悉的前提。但病毒载体的运用仍然存在技术较难、耗时间和不经济的问题
酵母质粒载体的特点
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增,故此类载体又称为穿梭载体(shuttlevector)。 在基因工程中,应用上述病毒表达载体在哺乳动物细胞中进行中、小规模的表达是十分实际的。还要有对组织培养技术十分熟悉的前提。但病毒载体的运用仍然存在技术较难、耗时间和不经
质粒的酵母直接转化
1．用牙签从平板中挑取单菌落（直径2～3mm），转移到1.5ml的无菌离心管中。2．将10μl载体DNA（100μg）与10μl转化质粒DNA混合，振荡均匀。（若转化DNA是用未经RNA酶处理的“mini－prep DNA”方法制得，则不需加载体DNA）。3．加0.5ml PLATE溶液，振荡。PL
酵母细胞中质粒的加工实验——从酵母细胞中分离质粒
利用一个假定的突变通过互补作用克隆酵母菌基因的一般方法。该突变为cdc101-1，它对酵母菌的生长来说既是隐性的又是温度敏感的。它使酵母可以很正常地在30°C生长，而不能在37°C形成菌落。如果用一个酵母菌基因组文库转化cdc101-1菌株，通过分离温度不敏感菌落，那么就可能分离到一个可以互补这种突
酵母细胞中质粒的加工实验_穿梭质粒
实验材料带有一个非URA3选择标记YCp载体试剂、试剂盒缺失成分平板+Ura含有5-FOAYCp质粒选择性培养基的平板YPD平板YIP5载体仪器、耗材培养皿实验步骤1) 构建染色体上重要基因被破坏的单倍体菌株以及含有完整重要基因和URA3选择标 记的YEp或YCp质粒。2) 对于诱发突变，将重要基因
酵母细胞质粒分离实验
在非选择性生长条件下，大多数大肠杆菌/酵母菌穿梭载体的丟失频率大约1%，采用本方案不易分离除去的一个质粒是内源性2 μm 质粒，2 μm DNA自发丢失的频率约为每代10-4。实验材料酵母试剂、试剂盒YPD仪器、耗材接种针培养瓶摇床实验步骤1. 挑取几个含质粒的酵母宿主菌菌落，接种于10 ml 非
酵母质粒载体的概念和分类
酵母质粒载体是基因表达载体的一种，既可以在大肠杆菌中、又可以在酵母系统中进行复制与扩增，所以也称为穿梭载体。它分为整合载体和自我复制载体两类。①整合载体：它带有一个酵母URA3标志基因和大肠杆菌的复制和报告基因。②自我复制载体：该类载体在酵母中可以自我复制。
关于酵母质粒载体的基本介绍
酵母质粒载体是基因表达载体的一种,既可以在大肠杆菌中、又可以在酵母系统中进行复制与扩增,所以也称为穿梭载体。它分为整合载体和自我复制载体两类。 ①整合载体：它带有一个酵母URA3标志基因和大肠杆菌的复制和报告基因。 ②自我复制载体：该类载体在酵母中可以自我复制。
酵母质粒提取离心法操作步骤
酵母质粒提取离心法操作步骤：1.接种5 mL含有酵母携带所需质粒的YDP培养液，将其振荡培养在30℃16-24小时。2.取1-3ml酵母培养菌体(使用< 2×107细胞)，室温下5000× g离心5 min。3.弃培养液，收集菌体，加入480μL Buffer SE和30μL Lyticase so
酵母菌落直接质粒转化法
酵母菌落直接质粒转化法1．用牙签从平板中挑取单菌落（直径2～3mm），转移到1.5ml的无菌离心管中。2．将10μl载体DNA（100μg）与10μl转化质粒DNA混合，振荡均匀。（若转化DNA是用未经RNA酶处理的“mini－prep DNA”方法制得，则不需加载体DNA）。3．加0.5ml PL
酵母细胞质粒分离实验
实验材料 酵母试剂、试剂盒 YPD仪器、耗材 接种针培养瓶摇床实验步骤 1. 挑取几个含质粒的酵母宿主菌菌落，接种于10 ml 非选择性培养基，于30℃培养过夜。 2. 在非选择性平板上于30℃培养2天以得到单菌落，大多数情况下，可以得到约200~300个单菌落（约每平板100个菌落）。 3.
质粒的转化及转化子的鉴定实验——电转化法
实验方法原理电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。实验材料外源片段与载体的连接产物大肠杆菌感受态细胞试剂、试剂盒X-galAmpLA培养基水抗生素仪器、耗
为什么要质粒转染
转染(transfection)：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。转染目的：研究你的目的片段到细胞内的表达。转染一般是将目的基因构建到某个载体，将构建好的重组质粒导入细胞中，这样就能表达你所要的目的蛋白用于后续实验。
酵母细胞中质粒的加工实验
定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术实验材料酵母菌株试剂、试剂盒带选择标记的YRp或YCp质粒适当的限制性内切核酸酶相应选择标记突变的酵母菌质粒标记的选择培养基平板仪器、耗材培养皿实验步骤1）将目的基因亚克隆到带恰当的选择标记的YRp或YCp质粒上。2) 在基因内部的两个限制酶酶切位点上切割以
酵母细胞中质粒的加工实验
实验方法原理 在非选择性生长条件下，大多数大肠杆菌/酵母菌穿梭载体的丢失频率大约1%。 在本方案中含质粒的酵母菌株接种于非选择性平板上以分离质粒并可得到单菌落。然后通过影印到选择性平板上可以鉴别丢失了质粒的菌株实验材料 含质粒的酵母菌株试剂、试剂盒 YPD或其他非选择性液体培养基及平板CM缺失成分
酵母质粒载体的基本信息介绍
酵母质粒载体是基因表达载体的一种,既可以在大肠杆菌中、又可以在酵母系统中进行复制与扩增,所以也称为穿梭载体。它分为整合载体和自我复制载体两类。①整合载体：它带有一个酵母URA3标志基因和大肠杆菌的复制和报告基因。由于质粒DNA与酵母基因组DNA之间发生了同源重组,在转化的细胞中可以检测到质粒的整
酵母质粒载体具备的条件有哪些？
一个理想的基因载体应该具有以下几个基本条件： ①能在宿主细胞进行独立和稳定的DNA自我复制,并在其DNA中插入外源基因后,仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性； ②易于从宿主细胞中分离,并进行纯化； ③在其DNA序列中,具有适当的限制性内切酶位点(最好是单一酶切位点)。这些位点位于DNA复制
提高自制酵母细菌电转化效率最重要的两点
一:生长期重要性无庸置疑,比如外源DNA基因组整合时,酵母通常选取OD600值为1-2左右.这是因为其时酵母分裂旺盛,细胞核膜较易被攻入(处于有丝分裂的前几期);同理,基因组DNA松散暴露,电转入的外源DNA较易整合; 细胞生命力也较强. 多种因素组合,使得转化率得以提高.二:将你的细胞洗干净些很多
酵母细胞质粒提取步骤和酵母细胞破壁方法
酵母细胞的细胞壁比较厚，不容易破壁，不如大肠杆菌的质粒 容易提取，最近做了些酿酒酵母的实验，从酿酒酵母中提取质粒，现在就总结下实验的方法和步骤。酵母细胞质粒提取 步骤1. 接种单菌落(待检测酵母细胞)于25mLYNB(补加氨基酸 营养物)培养基中，30℃振荡培养过夜。2.第二天取一滴菌液于进行显微镜
克隆化酵母DNA的操作实验——穿梭质粒
实验材料酵母实验步骤1. 构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株，及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。2. 将必需基因亚克隆到YCp载体（带有URA3以外的选择标志），取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。3. 转化至步骤1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省却成分平
为什么要将pei加到质粒里
这是程序就这么设计的。无论是转染还是转化，其关键因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA分子能够容易进入细胞内部。所以在习惯上，人们往往也通称转染为广义的转化。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。pei原理：外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、
克隆化酵母DNA的操作实验——质粒缺口修复
实验材料酵母实验步骤1. 将目的基因亚克隆到YRp质粒，通过基因内的两个限制性位点在基因中创造一个缺口区，在缺口两侧留下≥100~250 bp 的同源区，凝胶电泳纯化质粒骨架大片段。 2. 用1~10 μg 缺口质粒DNA转化待拯救的含突变等位基因的酵母菌株，通过YRp质粒上的选择基因进行选择，
电转化流程
一、电转化感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小
电转化流程
一、电转化感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小