NatNeuro|李翔团队揭示m6dA参与恐惧消除

　　恐惧引起的焦虑障碍影响着世界上数以万计的人。恐惧反应是机体基于对应激的判断而做出的一种具有自我保护性质的本能反应。然而，过度的恐惧则会导致包括焦虑症在内的一系列精神疾病，这类精神疾病具有一个共同的特征，即患者不能除去或者消散原有的恐惧记忆。创伤后应激障碍（Post-traumatic stress disorder，简称PTSD）就是由恐惧记忆紊乱产生的精神类疾病其中之一。近年来，在神经可塑性、学习和记忆的研究进展使我们对恐惧记忆的形成与消除的机理得到了进一步的了解【1-3】。

　　DNA甲基化，是表观遗传学中一个重要的机制。在不改变基因序列的情况下，通过对DNA碱基进行修饰来达到调节相关基因的表达。其特性，一度被认为是静态修饰，且仅限于指导早期发育过程中细胞谱系的特异性。现在被认为是一种处于活跃动态平衡中，并且可以在整个生命周期中发挥作用的可逆与和调节性修饰【4】。虽然，超过20种DNA修饰在不同的研究中被发现，但几乎所有旨在阐明表观遗传机制在大脑中作用的研究，都集中在5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。目前，对其他DNA的修饰在神经元以及大脑中的作用了解甚少。

　　N6-甲基-2'-脱氧腺苷（m6dA）是原核生物中最丰富的DNA修饰。在细菌中，m6dA调节复制，转录和转座。直到近年来，m6dA才在单细胞真核生物中检测到，随着研究检测技术的改进，m6dA在多重真核细胞基因组中发现具有极高的累积累积。例如，芝加哥大学的何川教授带领的团队就在衣藻中发现m6dA在转录起始位点（TSS）累积,并与基因表达的上升相关【5】；在果蝇中，m6dA水平在其终身都增加，并在转座因子处富集【6】。此外，在秀丽隐杆线虫中，m6dA与线虫的生殖能力，和跨代线粒体应激适应有关【7】。根据这些结果可以推测，m6dA可能在整个生命周期中，都发挥着调控基因表达的重要作用。最近的研究成果进一步充实这一猜想，m6dA不仅存在于哺乳动物基因组中，还在胚胎干细胞和成年小鼠脑中具有高度动态性，在慢性应激后，与LINE反转录转座子的活性呈负相关【8】。近期，m6dA被发现在基因体中富集，与人类细胞系中的基因表达呈正相关【9】，但对于m6dA在哺乳动物大脑特定神经元群体中的功能相关性知之甚少，在学习记忆行为中，m6dA在基因表达的作用尚未见报道。

　　对恐惧的抑制是是一种进化上保守的行为适应性，对生存至关重要。这个过程被称为恐惧消除（fearextinction），包括对先前学习突发事件的记忆，进行快速逆转，并且依赖于各种脑区域中的基因表达，包括infralimbic前额皮质（infralimbic prefrontal cortex，ILPFC）区。长期以来，恐惧记忆消除的啮齿类动物模型被认为是一种研究情绪化学习/记忆神经机制非常重要的工具，同时对于研究表观遗传机制在记忆过程中的作用也至关重要。利用该工具证明了ILPFC在恐惧消除过程中的重要作用以及ILPFC中的各种表观遗传机制与条件性恐惧的消退有关【2,3,10】。

　　2019年2月19日，来自澳大利亚昆士兰大学脑研究所的李翔团队在Nature Neurscience上发表长文“The DNAmodification N6-methyl-2’-deoxyadenosine (m6dA) drives activity-induced gene expressionand is required for fear extinction”,在此文中研究者详细探讨了m6dA在ILPFC中的作用，并阐明了m6dA参与恐惧记忆消除。

　　早在2014年的时候，研究者就发现在小鼠神经元中可能含有m6dA，利用DpnI对从激活性神经元中提取的DNA进行处理，研究者首次发现m6dA在神经元中富集。利用质谱以及点位杂交的方法进一步验证，发现m6dA在激活性神经元中含量升高，这让研究者对m6dA其在恐惧记忆消除中的作用产生了兴趣。

　　利用2016年何川教授实验室发明的DpnI-seq技术【11】，研究者结合流式细胞分选技术成功地研发出具有细胞特异性的检测m6dA的手段。通过在恐惧消除训练的成年小鼠的激活性神经元中的检测，发现m6dA在启动子和编码序列有相对较高累积，更有意思的是相关累积与基因表达量成正相关。同时还发现，在一些相关基因位点m6dA的累积只在激活性神经元中发生。

　　脑源性神经营养因子（Bdnf）是在神经元中合成的一种蛋白，其广泛分布于中枢神经系统内，对神经元的存活、分化、生长发育与作用起到重要的作用，同时该基因结构较为复杂，含有多个外显子以及启动子。Bdnf外显子IV在ILPFC的表达在一直是被认定为调控恐惧记忆消除的关键，之前有不同的研究表明，提高Bdnf外显子IV的表达可以提高啮齿类动物中恐惧记忆消除的能力。研究者发现通过恐惧记忆消除训练，在BDNF IV的启动子中有显著m6dA的累积，而且这个现象只在激活性神经元中产生，同时在其他的Bdnf启动子中没有发现m6dA的累积。敲除m6dA的转移酶后，可以抑制此基因位点的m6dA累积，同时降低Bdnf IV mRNA的表达，进而降低小鼠的恐惧记忆消除能力。

　　总之，此项研究扩充了成年大脑中DNA修饰的范围与认识，同时发现了m6dA作为新的一种表观遗传机制，参与调控基因表达和恐惧消除记忆形成相关的变化。

　　值得一提的是，这项工作2016年6月22日就发布在预印本杂志bioRxiv上了，2018年7月25日又提交了修改版，论文署名稍微有一点差异。到论文正式发表出来之后，论文标题又又有所修改。所以说，这篇文章从投稿到最终正式发表经历了一段漫长的岁月。

　　参考文献

　　1. Marshall, P. & Bredy, T. W.Cognitive neuroepigenetics: the next evolution in our understanding of themolecular mechanisms underlying learning and memory? NPJ Sci. Learn. 1, 16014 (2016).

　　2. Li, X. et al. NeocorticalTet3-mediated accumulation of 5-hydroxymethylcytosine promotes rapid behavioraladaptation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 7120–7125 (2014).

　　3. Wei, W. et al. p300/CBP-associatedfactor selectively regulates the extinction of conditioned fear. J. Neurosci.32, 11930–11941 (2012).

　　4. Gapp, K., Woldemichael, B. T.,Bohacek, J. & Mansuy, I. M. Epigenetic regulation in neurodevelopment andneurodegenerative diseases. Neuroscience 264, 99–111 (2014).

　　5. Fu, Y. et al. N6-methyldeoxyadenosinemarks active transcription start sites in Chlamydomonas.Cell 161, 879–892 (2015).

　　6. Zhang, G. et al. N6-methyladenineDNA modification in Drosophila. Cell 161, 893–906 (2015).

　　7. Ma, C. et al. N6-methyldeoxyadenineis a transgenerational epigenetic signal for mitochondrial stress adaptation.Nat. Cell Biol. https://doi.org/10.1038/s41556-018-0238-5 (2018).

　　8. Wu, T. P. et al. DNA methylation onN(6)-adenine in mammalian embryonic stem cells. Nature 532, 329–333 (2016).

　　9. Yao, B. et al. DNA N6-methyladenineis dynamically regulated in the mouse brain following environmental stress.Nat. Commun. 8, 1122 (2017).

　　10. Bredy, T. W. et al. Histonemodifications around individual BDNF gene promoters in prefrontal cortex areassociated with extinction of conditioned fear. Learn. Mem. 14, 268–276 (2007).

　　11. Luo, G.-Z. et al. Characterization of eukaryotic DNA N(6)-methyladenine by ahighly sensitive restriction enzyme-assisted sequencing. Nat. Commun. 7,11301(2016).