哺乳动物的细胞核移植

实验概要

本实验哺乳动物为实验材料介绍细胞核移植技术。

实验原理

细胞核移植，就是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个细胞里去。前者为供体，可以是胚胎的干细胞核，也可以是体细胞的核。受体大多是动物的卵子。因卵子的体积较大，操作容易，而且通过发育，可以把特征表现出来，因此细胞核移植技术，主要是用来研究胚胎发育过程中，细胞核和细胞质的功能，以及二者间的相互关系；探讨有关遗传，发育和细胞分化等方面的一些基本理论问题。该技术已有几十年的历史。1952年，Briggs   和King在两栖类动物中首次获得核移植成功，使得发育生物学上的几个根本问题得到了解答。Gurdon用非洲爪蟾的上皮细胞等体细胞的核作移植，确立了已经分化的细胞核可以正常发育的事实。我国胚胎学家童第周先生等在鱼类细胞核移植方面做了许多工作。他们在1976年前后首次获得的鲤鲫移核鱼，不仅有理论意义，而且也为鱼类育种开辟了一条新的途径。

哺乳动物的细胞核移植也早已引起关注，因哺乳类受精卵极小，体外培养和细胞核移植技术难度大，因此直到1981年IIImensee和Hoppe才首次报道获得成功。Mcgrath和Solter  在1983年发表了用核移植技术与细胞融合相配合的方法，能将90%以上的移核卵培养到胚泡期。经过胚胎移植，均可获得一定比例的核移植小鼠。

主要试剂

1. 手术液：即 Holtfreter液，需煮沸消毒

2. 分离液：

NaCl 0.35g

KCl 0.005g

双蒸水 100ml

待以上混合液煮沸消毒冷却后加入

EDTA(乙二胺四乙酸)18.6mg

NaHCO₃ 0.02g

3. Ringer液

4. 70%酒精

5. 2%琼脂

主要设备

1. 显微操作器

2. 显微注射器

3. 拉针器

4. 酒精喷灯

5. 虹膜剪刀

6. 尖头钟表镊

7. 内径12.5px，7.5px玻璃管

8. 1mm玻璃毛细管

9. 玻璃针

10. 培养皿

11. 弯头吸管

12. 毛细吸管

13. 微吸管

14. 温箱

15. 双目解剖镜

16. 显微镜

实验材料

昆明白小鼠，黑小鼠（C₅₇BL―6）

实验步骤

1. 取卵

2. 去核卵的制作

用白色小鼠的受精卵作受体，在有相差干涉装置的显微镜下，将预先备好的移核针管头端，借助显微操作器刺入受精卵的透明带，让针头仅穿过透明带而不刺破卵子的质膜。再用针口对准雄核，隔着质膜将其吸入针管内。然后将针口对准雌核，以同样的方法将雌、雄原核吸至针管前端，随即慢慢拔出针管。此时可见到卵子质膜弹性很大，在管口与透明带之间质膜被拉成细丝，然后断开，形成只有细胞质的去核卵和在针管内有两个原核和少量细胞质，外有质膜包裹的两个部分。该去核卵即作受体用。

3. 细胞核移植

用同法将作供体的黑小鼠受精卵的雌、雄原核吸入针管内，然后吸入少许仙台病毒（Inactivatied  Sendai  Viras），再将上述针管移至去核卵，让管口穿过透明带原有的小孔进入卵周隙，此时轻轻转动注射器，使外有质膜包裹的雌、雄原核和仙台病毒一起进入受体卵的透明带与质膜之间的卵周隙，然后把针管缓缓抽出即可。如继续观察，能见到在病毒的作用下，移入细胞核所带的质膜与去核的质膜接触处，质膜慢慢溶化消失，雌、雄原核进入受体卵的融合过程。该移核卵子，实际是核质杂交。如果操作成功，在二氧化碳培养箱内培养，  90%以上的卵子可发育至胚泡期，经过胚胎移植可获得核移植的核质杂交小鼠。

在核移植的全过程中，每一步骤均需严格操作，尽量减少对细胞膜、质和核的损伤，所用的器皿也需严格消毒，防止污染，以提高各个步骤的成活率。