TE-饱和酚/氯仿提取法
实验方法原理 | 大多植物病毒RNA 为单链RNA ,并且其极性与mRNA 极性相同,植物病毒RNA 提取较为简单,一般使用酚氯仿即可获得满意结果。 |
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实验材料 | TMV病毒液 |
试剂、试剂盒 | TE-饱和酚:氯仿 氯仿 NaAc 乙醇 TE缓冲液 双菌水 |
仪器、耗材 | 冷冻台式离心机 低温真空干燥仪 电泳仪 电泳槽 |
实验步骤 |
一、实验材料准备 提纯TMV病毒液(10 mg/ml)。 2. 设备 冷冻台式离心机,低温真空干燥仪,电泳仪,电泳槽。 3. 试剂 TE-饱和酚:氯仿(1:1),氯仿,3 M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE缓冲液,无RNA 酶的双菌水。 二、操作步骤 1. 取一eppendorf管加入提纯TMV(10 mg/ml)400 ml,再加入等体积酚/氯仿,盖紧管盖后用手充分振荡1分钟,4℃下12 000 g离心10分钟。 2. 吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止。 3. 吸取水相于新eppendorf心管,加入等体积氯仿,用手倒置离心管数十秒,4℃下12 000 g离心10分钟。 4. 取水相,加入1/10倍体积的3 mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。 5. 4℃下12 000 g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12 000 g离心5分钟。 6. 小心弃去上清液,沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟,并溶于无RNA 酶的双菌水或TE缓冲液中。 7. 取10 ml进行电泳分析。
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注意事项 |
1. 整个操作应尽可能在低温下进行。 2. 由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面,因此要充分剥去病毒外壳蛋白,一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。
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