发酵产氢菌株与混合培养系统种群生态研究

近年来基于乙醇型发酵制氢工艺和理论,开展了大量以提高该工艺的产氢效率、完善工程控制对策、实现工业化生产为最终目的的理论和应用研究。筛选出若干株产乙醇杆菌,获得了大量工程控制数据,研究取得了很大的进展。但是乙醇型发酵制氢工艺的工程控制对策还有待完善,产氢效率还有待进一步提高。尤其是混合菌种乙醇型发酵产氢系统的生态学机制还未完全揭示,监测手段尚需完善。本论文就是以乙醇型发酵产氢系统为核心,对筛选出的产乙醇产氢菌株进行了鉴定,并利用改进的FISH监测技术对混合菌种发酵产氢系统的细菌种群生态进行了深入研究。分离出2株乙醇型发酵产氢菌株C12,C3。经生化和电镜以及分子生物学技术,比较了它们与本实验室原有菌株——哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)B49的形态特征、生理生化特征和产氢影响因子,分析了它们的16S rDNA序列和系统发育关系,以及16S-23S rRNA基因间隔区序列的相似性,确定它们应同属于哈尔滨产乙醇杆菌。并在此基础上进行了设计产乙醇杆菌属(Ethanoligenens)专一性16S rRNA寡核苷酸探针的研究。结果证明在16S rRNA基因序列中不存在产乙醇杆菌属的专一性寡核苷酸探针靶序列,应该在23S rRNA基因序列和16S-23S rRNA间隔区序列中寻找可能的片段。对已有的环境微生物FISH实验技术进行了改进。筛选出适合用于发酵产氢菌群动态监测的寡核苷酸探针Chis150,Ent183和HGC等,并确定了它们的最佳杂交条件。初步建立了以梭菌属、产乙醇杆菌属和肠杆菌科为监测对象的FISH监测系统。然后在对以往的FISH实验方法进行分析、比较和预试验的基础上,简化了操作步骤,优化了实验条件,降低了实验成本,使之更加适合于混合菌种发酵产氢系统的快速监测。应用改进的FISH技术,监测了连续流搅拌槽式(CSTR)发酵制氢反应器的启动阶段、乙醇型与丁酸型2种产氢发酵类型运行过程和发酵类型转化过程中的目标菌群动态,以及厌氧折流板式发酵产氢系统(ABR)中的目标菌群丰度等,并深入分析了种群生态对产氢速率、生物量和发酵产物的影响及其与发酵类型的关系。首次发现梭菌属、产乙醇杆菌属和肠杆菌科在决定产氢发酵类型方面有重要作用。乙醇型发酵以梭菌属和产乙醇杆菌属为优势种群,丁酸型发酵以肠杆菌为优势种群。指出在混合菌种发酵产氢系统启动期有机负荷和pH值共同影响发酵类型的形成,而运行期pH值是最重要的调控因子,并对工程控制对策提出了相应建议。