悬浮细胞培养经验

　　6 细胞培养基的选择

　　6.1根据细胞特点、蛋白表达及病毒特点和培养方式选择细胞培养基

　　商售工业用细胞培养基主要是干粉培养基，常用的培养基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12等系列，根据细胞的特性及工业化的生产需求，开发或生产的同一系列的细胞培养基在成份上也有一定的变化，如MEM细胞培养基有含Earle's平衡盐的类型，也有含Hanks'平衡盐的类型；依据除菌方式又可分为高压灭菌型和过滤除菌型；还有含非必需氨基酸的类型，及是否含有酚红等；DMEM培养基分为高糖型和低糖型，据此结合实际培养的细胞特点、产品特点及生产工艺等进行选择和优化，最终选择的培养基需要达到以下目标：

　　1.提高细胞密度和细胞活力；

　　2.提高单位体积培养液中病毒量或抗体表达量，提高生产效率；

　　3.降低动物来源成份，简化纯化成本，提高生物制品的安全性。

　　不同的细胞株甚至同一细胞株在不同的培养条件下都有着不同的营养需求，细胞作为病毒等繁殖的宿主，为细胞株选用合适的培养基，使细胞保持快速增殖和高活率状态，才能够提高生物制品的产率。在选用合适的细胞培养基时可根据以下几种方法进行：

　　可从细胞系最初建系用培养基，也可从细胞的来源处获得，细胞库（如ATCC、ECACC）可以提供常用细胞系所用培养基的信息。但该种细胞培养基通常选择的是最基础的培养基。

　　1.还可用多种细胞培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据试验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁锁。

　　2.也可根据本实验室惯用的细胞培养基，许多培养基可以适合于多种细胞，通过几种培养基的选择测试进行挑选，亦可参考一些经验（见表6-1），缩小选择的范围。

　　3.针对细胞特点及培养工艺需要。

表6-1 传代细胞系常用的细胞培养基

　　培养细胞的目的是使其表达生产相应的目的物，因此，在满足细胞生长增殖的基础上，细胞培养基的开发还应满足病毒等在细胞中的高表达及性能稳定性。同一株细胞可以作为几种生物制品的生产平台（如上表中所列）、同一病毒液可在几种宿主细胞中表达，因此，选择最优化的宿主细胞及最高产品表达量是生物制品厂家追求的一个目标，而相应细胞培养基的正确选择是促使目标实现的一个重要影响因素。LONZA公司2005年【12】研究结果表明，同一细胞株，采用优化后的限定化学成份细胞培养基与传统的合成细胞培养基相比，蛋白表达量提高了9.6倍，从该结果可以看到细胞培养基的选择和优化对于提高产物表达量的重要性。

　　生产工艺的革新或改进是提高生产效率、降低生产成本的一个有效途径，相应细胞培养基的支持显得较为重要。如由转瓶培养转换为生物反应器培养时，传统的合成细胞培养基较难满足生物反应器中细胞的高密度生长、抗剪切力、降低表面张力等需要，则需要更换相应的悬浮培养用细胞培养基满足上述需求。在有血清悬浮培养转至无血清悬浮培养时，缺少了血清的保护和促增殖作用，相应无血清培养基的支撑显得更为重要。

　　随着细胞培养技术及基因工程技术的发展，细胞株的改造和驯化技术提高，高表达细胞株或是悬浮细胞株（贴壁细胞悬浮化培养等）的构建、驯化，如细胞由贴壁培养状态向悬浮培养状态转换时，或是在有血清悬浮培养转至无血清悬浮培养时，细胞的代谢状况可能发生改变，传统用细胞培养基可能不能适应改造后或是驯化后细胞株的生长增殖需求，相应个性化细胞培养基的支撑显得更为重要。相应个性化细胞培养基的支撑显得更为重要。这些个性化细胞培养基或是直接来自细胞培养基生产厂家的革新、或是与使用者共同开发定制的专业化细胞培养基。

　　6.2选择高品质的细胞培养基

　　细胞培养基作为原材料直接影响生物制品的质量。无论是国产细胞培养基还是进口细胞培养基，由于国内目前还无明确的法律法规来规范细胞培养基的产、销过程，各企业执行各自的生产工艺及产品配方，由于信息的不对称，细胞培养基生产企业存在的诸多问题，尤其是安全性问题并不能被用户所了解。生物制品生产企业需筛选真正符合生物制品原材料质量要求的培养基，从源头上控制好生物制品的安全风险，需建立基本的产品检验标准，尤其在没有统一法规、行规的条件之下，只能通过挑选合格的供应商、自身建立一套质量检验体系，对每批产品进行检验等确保培养基的质量。

　　6.3从经济性、安全性角度选择合适的细胞培养基

　　随着生物制品安全性要求的提高，细胞培养基作为生物制品的一个重要原材料，直接影响其产品的质量和安全性。当前，基于人、蓄安全性角度考虑，国外许多法规要求采用不含动物组份的细胞培养基，无动物来源成份的无血清细胞培养基将是生物制品企业选择的趋势所在。

　　除满足安全性需求外，选择细胞培养基时价格也是不得不考虑的一个因素。工业化通常直接购买供应商的干粉细胞培养基，有些培养基可能需要添加谷氨酰胺，大部分基础合成细胞培养基中需要添加一些血清。随着对生物制品安全性要求的提高，并满足生物制品体外生产时需要去除动物蛋白的要求，针对一些连续细胞系，设计了个性化的低血清细胞培养基及无血清细胞培养基，虽然这些培养基的价格较为昂贵，但相比血清给后期纯化及产品质量带来的影响，这些培养基生产的产品质量和安全性明显较高，相应产品的市场竞争力增强、市场占有率提升，企业的最终的生产效益提高。

　　6.4供应商的选择

　　选择细胞培养基的同时也需考核、选择供应商。

　　目前，国内细胞培养基行业管理存在缺失现象，国内细胞培养基行业没有统一的生产质量管理规范。生物制品企业除自身建立一套质量检验体系外，挑选合格的细胞培养基供应商是进行原材料质量控制的另一种重要的方法。选择供应商时可通过对比细胞培养基生产企业在硬件和软件上的情况和差距，对细胞培养基的原材料、生产过程、生产环境、生产用设备、应用性检测、安全性检测等方面检查并评估供应商的生产、质控能力。

　　国产与进口细胞培养基的生产及销售渠道可能会有一定差别，进口产品供货周期有一定限制，在国产和进口培养基均能够满足生物制品厂家要求的时候，国产细胞培养基相应是较好的选择，原因主要包括两个方面，一方面国产细胞培养基在价格上存在优势，生产同样的产品，与国内细胞培养基厂家相比，技术水平和可信度较高的国外细胞培养基厂家通常整体规模较大，相应的产品生产及运营费用较高，导致产品价格昂贵；另一方面，细胞培养基使用厂家可直接考核国内供应商，易于使用厂家控制细胞培养基的质量，并更易获得产品性能相关的技术支持及售后技术服务。