β内酰胺酶单克隆抗体和多克隆抗体的制备（上）

β-内酰胺酶单克隆抗体和多克隆抗体的制备

目前，在我国奶牛养殖业中，青霉素和头孢菌素等β-内酰胺类抗生素对奶牛乳房炎等疾病的控制起着十分重要的作用。由于一些奶牛养殖商户滥用抗生素以及未严格遵守休药期，致使牛奶中抗生素残留超标，乳中残留的抗生素严重危害食品安全和人体健康。我国政府对超过一定限量抗生素的原料乳实施标准控制。国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购或不收购，而一些不法奶站使用一些生物制剂降解牛乳中残留的抗生素，生产出人造"无抗奶"。

经过调研，初步判断市售生物制剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的多种酶组成的酶家族，相对分子质量在28～32ku之间，可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶能够破坏青霉素内酰胺结构，使其失去活性。该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。崔生辉等人2007年曾在北京零售超市中采集5个厂家生产的、不同种类的牛奶样品38个，其中63.2%的样品检测出β-内酰胺酶。β-内酰胺酶为我国禁用的食品添加剂之一，它可导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低人们抵抗传染病的能力，给消费者的身心健康带来危害。我国于2009年和2011年公布的食品和饲料中非法添加的非食用物质名单中，β-内酰胺酶（金玉兰酶制剂）两次上榜，且认定的检测方法为液相色谱法。

原乳中β-内酰胺酶的检测方法有微生物杯碟法、快速试剂盒法、液相色谱法和双流向酶联免疫法。微生物杯碟法成本低廉。试剂盒法和酶联免疫法依据抗原抗体特异性反应的基本特性，操作简单，速度快，特异性好。液相色谱法具有操作时间短、灵敏度高、准确的特点，但所需实验仪器要求较高。

本研究中制备β-内酰胺酶的多克隆抗体和单克隆抗体，拟通过双抗夹心法为后续的胶体金免疫层析试纸条的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物：日本大耳兔（雌性，两月龄），北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司；Balb/C小鼠（雌性，SPF级，六周龄）、昆明小鼠（18～22g），购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

实验试剂：β-内酰胺酶，Sigma公司；青霉素酶，中国药品生物制品检定所；牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉，北京经日今典科技有限公司；单组份TMB显色液，北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，北京优博奥生物科技有限公司；HAT、 HT、PEG2000、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，Sigma公司；小鼠SP2/0细胞，本实验室保存；DMEM低糖培养基，GIBCO公司；小鼠单克隆抗体亚型试剂盒，洛阳赛尔维实验器材有限公司。

仪器和设备：96孔聚苯乙烯酶标板、细胞培养板，JETBIOFIL公司；酶联免疫检测仪、凝胶成像仪，BIO-RAD公司；紫外分光光度计，UNICO公司。

1.2 免疫抗原的选择

使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析β-内酰胺酶和青霉素酶两种蛋白的分子质量及纯度。分离胶10%，积层胶4%，电泳缓冲液为甘氨酸。

1.3 多克隆抗体的制备

使用β-内酰胺酶对3只日本大耳兔进行免疫。对每只大耳兔，取700μgβ-内酰胺酶，用pH7的0.1mol/LTris-HCL稀释至 500μL，与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后于兔子背部皮下和两侧腹股沟多点注射。之后的加强免疫使用同剂量免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化，背部皮下多点注射，每次免疫间隔两周。自第3次免疫起，每次免疫4d后于兔子耳缘静脉采血，分离血清，检测免疫效果。五免后3d心脏采血，分离血清。

1.4 ELISA筛选方法的建立

1.4.1 包被原浓度的确定采用方阵法，用系列浓度稀释的青霉素酶横向包被96孔酶标板，将倍比稀释的一抗纵向加入，用间接ELISA法确定最佳抗原包被浓度。

1.4.2 包被条件的确定选择4℃overnight，37℃1h，37℃2h3种方式包被，以确定最佳包被条件。

1.4.3 封闭液的选择选择0.2%明胶、5%脱脂奶粉、3%山羊血清、5%小牛血清、0.75%奶粉+2%BSA+5%蔗糖、3%BSA+0.05%吐温+3%蔗糖、5%奶粉+0.05%吐温+3%蔗糖7种封闭液封闭，确定最佳封闭液。

1.4.4 封闭时间的优化封闭时间选择0.5，1，2h，采用间接ELISA确定最佳封闭时间。

1.5 单克隆抗体的制备

1.5.1动物免疫将9只雌性Balb/C小鼠分为3组，高、中和低3个剂量组每次免疫分别为200，100和50μg/只。首次免疫取相应剂量的 β-内酰胺酶，溶于50μl 0.1mol/L Tris-HCL（pH7）中，于等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后小鼠后颈背部多点注射。两周后使用同剂量免疫原与弗氏不完全佐剂乳化作第2次免疫，于腹腔皮下注射。第

3次免疫后，ELISA法检测小鼠抗血清的效价。在3组中选取效价最高的小鼠做融合，融合前3d腹腔注射相同剂量的抗原液作加强免疫。

1.5.2 SP2/0骨髓瘤细胞的培养用8-氮杂鸟嘌呤（20μg/mL）处理3代体外培养的SP2/0骨髓瘤细胞，对数生长期时皮下注射Balb/C小鼠背部两侧，每只小鼠注射5×105～1×106个细胞。实体瘤直径长至2～3cm时，无菌解剖摘取，200目的筛网研磨过滤，重新培养至细胞稳定生长。

1.5.3 细胞融合融合前1d使用昆明鼠培养饲养细胞。取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞，用50％PEG2000按常规方法融合，使用建立的青霉素酶间接ELISA法检测培养上清。选择强阳性孔，用有限稀释法连续亚克隆4～5次，直至克隆孔100％分泌抗β-内酰胺酶抗体。将建立的稳定、高效价分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩增培养，传3代及冻存复苏后仍能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，然后置液氮中保存。

1.5.4 腹水抗体的制备采用体内诱生法制备腹水。取Balb/C小鼠腹腔注射灭菌石蜡油0.5mL/只，两周后注射抗β-内酰胺酶的杂交瘤细胞5×105个/只，1周后收集小鼠腹腔液。

1.6 抗体的特性分析

使用间接ELISA法对多克隆抗体和腹水中的单克隆抗体效价进行测定，多克隆抗体以空白血清作阴性对照，单克隆抗体以SP2/0骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照；采用非竞争酶免疫试验对单克隆抗体的亲和力进行测定；使用亚型鉴定试剂盒对杂交瘤细胞株进行亚型鉴定。采用秋水仙素裂解法对杂交瘤细胞株进行染色体分析。使用Westernblotting对单克隆抗体的分子质量和特异性进行测定。