单抗到底是怎么⽣产的？

　　单抗到底是怎么生产的？

　　单克隆抗体(MAb)是针对专一的抗原决定簇产生的抗体，单克隆技术⼜名杂交瘤技术起源于1975年，由G.KÖhler和Milstein创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。

　　杂交瘤技术制备单克隆抗是针对体的主要步骤包括：

　　(1)抗原制备；

　　(2)免疫动物；

　　(3)免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

　　(4)细胞融合；

　　(5)杂交瘤细胞的选择培养；

　　(6)杂交瘤细胞的筛选；

　　(7)杂交瘤细胞的克隆化；

　　(8)单克隆抗体的检定；

　　(9)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

　　(10)单克隆抗体的大量制备。

　　单克隆抗体的制备过程：

　　1、免疫动物

　　免疫动物是用⽬的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫⽅案进⾏免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进⼊外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

　　2、细胞融合

　　采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平⽫内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定⽐例混合，并加⼊促融合剂聚⼄⼆醇。在聚⼄⼆醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

　　3、选择性培养

　　选择性培养的⽬的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA⽽死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本⾝不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

　　4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

　　在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进⾏筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进⾏杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学⽅法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进⾏克隆扩增。经过全⾯鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和⼒、识别抗原的表位及其分⼦量后，及时进⾏冻存。

　　5、单克隆抗体的大量制备

　　单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。

　　(1)体内诱生法 取Balb/c小鼠，⾸先腹腔注射0.5ml液体⽯腊或降植烷进⾏预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹⽔，即可获得大量单克隆抗体。

　　(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进⾏培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离⼼去除细胞及其碎⽚，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种⽅法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提⾼了抗体的生产量。杂交瘤细胞融合后，要进⾏筛选后才能使用。杂交瘤细胞分为两次：一、筛选出杂交瘤细胞；⼆、在初选的杂交瘤细胞中筛选出能产生特异性抗体的杂家瘤细胞，这两次筛选的⽅法和原理各不相同。