单克隆抗体的制备（一）

材料

1. 免疫原

一旦作出制备单克隆抗体的决定后，首先要考虑的问题是使用何种免疫原(第2章）。免疫原(或抗原）可以有多种：全细胞、细胞提取物、纯化蛋白、融合蛋白、多肽、糖 类 、脂类或 D N A 等 。此外，制备单克隆抗体时不需要很纯或单一特异性的抗原，因为在单克隆抗体筛选的过程时，每个克隆的特异性都会得到体现。全细胞或细胞裂解物（每 次 注 射 I07个细胞）可以作为细胞内或细胞外抗原分子的天然形式; 但特定抗原含量的多少会影响免疫的效果。过度表达特定蛋白质的细胞系通常是很好的抗原来源。纯化的重组蛋白或融合蛋白也是常用的免疫原(每次注射10〜IOOug), 可以产生针对很多不同抗原表位的抗体 。如果免疫原是以融合蛋白存在，重要的是还要制备免疫原本身或免疫原与其他蛋白质的融合蛋白，以便在筛选特异性抗体时，得到针对免疫原的单克隆抗体而不是针对融合蛋白另一部分的单克隆抗体。类似的，多肽抗原(大于1 0 个氨基酸)必须与载体蛋白偶联

才能用于免疫。由于这些载体蛋白具有很高的免疫原性，所以多肽应该与不止一种载体蛋白偶联，以便筛选出的单克隆抗体只识别多肽而不识别载体蛋白，如钥孔戚血蓝素(KLH) 和牛血清白蛋白。抗多肽的抗体能鉴别小的线性序列，并且已经被证明能有效地区别靶标是否被修饰，如区分特定肽上的磷酸化或去磷酸化。

近年来，用质粒为基础的技术在体内诱导表达有免疫原性蛋白的新方法已经产生。基因免疫接种在采用下列免疫途径时是相当有效的：脾内注射、肌肉注射[2]、皮内注射（用基因枪[3, 4]等仪器设备进行操作）或静脉注射[5〜 7]等 。这些方法的不同在于将质粒DNA导入宿主细胞的机制不同。然而，每种方法都依赖于哺乳动物表达载体上的独特编码序列 ，这些外源D N A 序列随后被宿主细胞摄取，在体内产生蛋白质。更有用的是，当抗原难以制备或基因产物不清楚时，基因免疫接种可以被运用。质粒为基础的免疫可在体内产生足量的目标蛋白，从而诱导机体产生强有力的体液免疫应答。这种技术还可用在转基因小鼠，产生针对靶抗原的特异性抗体[5』 5a]。

糖类决定基往往表达在病原微生物表面，可以引起适度的体液免疫，但很少引起再次免疫应答。因此，糖类决定基通常只能诱导产生1 g M 的抗体应答，如针对血型抗原的应答 。将糖类抗原偶联在载体蛋白质上后也能增强机体对它的应答。游离的脂质或者脂蛋白 经 C D l分子的抗原提呈后可以诱导产生与这些半抗原样片段反应的抗体。核酸很难诱导体液免疫的产生。

总的来说，抗体分子识别的蛋白质抗原决定基分为三种类型：构象表位、线性表位以及新表位。构象表位是由序列上不相连续的多肽(非线性序列）形成的具有三维结构的表位 。构象表位表示抗原是以天然形式存在的，当蛋白质分子变性时，构象表位会被破坏。线性表位（由相邻氨基酸残基组成的序列）不会因蛋白质变性而破坏，但是当蛋白质处于天然折叠状态时，线性表位可能暴露也可能隐藏在分子内部。抗体结合的线性多肽就是

线性表位的一个例子。新表位是指天然蛋白质水解后新表达的表位。识别新表位的抗体通常不能识别天然蛋白质。

显然，免疫原的形式会影响宿主体液免疫产生的抗体谱。用全细胞、细胞裂解物或者用在体内产生的蛋白质免疫接种会导致产生大量的抗体，这些抗体可用来鉴别表达在天然蛋白质上的抗原表位(构象表位、线性表位和新表位）。这些抗体可能用于广泛生物学功能的研究，包括流式细胞术或功能性中和作用。多肽免疫接种通常只是单一抗原表位的暴露。识别这些线性表位的抗体并不总能结合天然球状蛋白；然而，这些线性表位即便在天然蛋白质变性的情况下通常也是能保存的。这种抗多肽的抗体通常在免疫印迹(Western blot)或免疫组化中工作得很好。因此，选择免疫原制备抗体时应该考虑到所

制备抗体的最终用途, 并应该根据其用途决定用何种方法筛选抗体更合适。虽然不能保证某一种形式的免疫原将会产生有特定功能活性的抗体，但是具有帮助我们筛选到具备独特特异性的抗体的可能性。所需用于免疫接种和抗体初步筛选的蛋白质抗原量大约是 2 mg。

在免疫接种前，检查抗原中是否含有潜在病原体是必要的。这适用于用细胞系、细胞系产生的蛋白质，或者在有血清存在的情况下制备的蛋白质。筛选试验，称为小鼠抗体生产筛查试验（mouse antibody production screening ,MAPS) ，包括用每种特定抗原（2 XIO7 个细胞或10〜IOOug蛋白质）接种经检疫的无特定病原体（SPF)动 物 ，观 察 4 周 。 4周 后 ，收集免疫后动物的血清，和免疫前的血清比较对一系列已知病原体的反应。阳性结果意味着抗原已被污染，应当抛弃；阴性结果表明抗原是安全的，可用于体内注射。

2 免疫用的动物

小鼠、大鼠、亚美尼亚仓鼠和兔中分离的淋巴细胞的杂交瘤技术已经很成熟。小鼠是极好的免疫接种对象，原因是：多个纯系株易得到且价钱合理; 小鼠易操作; 有很多试剂可用以检测鼠源免疫球蛋白；小鼠对外来蛋白质能产生良好的免疫应答。另外，小鼠淋巴细胞能够和多种鼠源骨髓瘤细胞系发生有效融合（表 5. 1)。此 外 ，在免疫系统功能得以保留的情况下，基因打靶(gene-targeted)小鼠能够产生针对特定靶蛋白的抗体。大鼠同样是一个好的宿主，尤其是在制备针对小鼠蛋白的抗体时。小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞都可以与大鼠的 B 细胞融合。亚美尼亚仓鼠是独特的模型，因为从系统发生学上它们的亲缘关系和小鼠相差甚远，所以能够对小鼠、大鼠或人类来源的蛋白质产生良好的免疫应答，而且能够和小鼠骨髓瘤细胞系发生有效的融合[8』 9,9a ]。更重要的是，亚美尼亚仓鼠产生的抗体在小鼠体内是无免疫原性的，使它们成为一些疾病的理想的体内模型[9——u ， lla]。这种模型已经广泛用于制备高亲和力的针对小鼠细胞因子、受体和转录因子等的抗体。常 用 的 骨 髓 瘤 细 胞 系

兔的杂交瘤细胞是由免疫兔的脾细胞和兔的骨髓瘤细胞系融合得到的[17]。因此，根据免疫原的来源和抗体的最终用途，一系列的动物模型可供选择用于制备具有所需特异性和功能的独特的单克隆抗体试剂。

一种替代细胞融合制备单克隆抗体的方法是使用淋巴细胞条件转化鼠Cimmortom 〇use)[18]。这些转基因小鼠携带SV4 0 T 抗原的温度敏感突变体，该 基 因 由 H-2Kb 启动子控制。免疫上述转基因动物后，脾细胞在允许的33°C 的培养条件下能够表达热不稳定的 SV40 T 抗 原 ，导 致 B 细胞的转化，从而不需要与永生细胞系融合，而且还避免了由于异核体细胞（杂交瘤细胞）的产生而出现的不稳定现象。从 这 些 不 断 生 长 的 B 细胞中能筛选到分泌特异性抗体的细胞株。

在完善的杂交瘤技术的基础上努力开发更加有效的完全人源化抗体，促使了 Abgenix公 司 XenoMouse的发展[19』 2°]。这 些 转 基 因 小 鼠 完 全 缺 乏 小 鼠 和 「 基因，致使它们缺之所有类型的小鼠免疫球蛋白。这 些 缺 乏 和 Ck 基因的小鼠（Ig基因一/一小鼠）也可通过转基因的方式导入人类IgH及 IgK链基因。因此，转 基 因小鼠XenoMouse具有类似于成年人那样的能够产生多样性初始免疫应答能力的遗传成分，在接受抗原刺激后能够产生强有力的再次应答。常规免疫这些转基因小鼠，将免疫小鼠脾细胞与小鼠源骨髓瘤细胞融合, 是制备一系列高亲和力的能够和任何数量蛋白质反应的完全人源化抗体的新策略。这些抗体具有中和活性，很多已被批准用于人类疾病的治疗。