单克隆抗体技术

实验概要

显微镜下观察血片或骨髓片，找出异常细胞。

实验原理

B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂；而骨髓瘤细胞可以在体外无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后，用一特殊选择培养基(HAT)阻断正常细胞或自体融合细胞的DNA合成通路，而杂交瘤细胞可利用补救通路合成DNA得以生存，且既能产生抗体，又能无限增殖，并以此生产抗体的技术。单抗技术是主要由抗原制备，免疫动物，细胞融合，筛选杂交瘤细胞，克隆化培养，单克隆抗体的大量制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，其核心部分是细胞融合。

细胞融合是单克隆抗体技术的中心环节，基本步骤是将脾细胞和骨髓瘤细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。

主要试剂

50%PEG，不完全培养液，HAT培养液，75%酒精。

主要设备

剪刀，镊子，纱布，离心管，网筛，大小瓶皿，直头滴管，弯头滴管，瓶塞，培养瓶盖，离心管盖，烧杯(加入37℃水)，泡沫板，大头针，96孔培养板，计时器，显微镜，计数板等。

实验材料

Balb/c小鼠，SP2/0骨髓瘤细胞。

实验步骤

1. 饲养细胞的制备

   1) 常用Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于75%酒精内，3～5min。

   2) 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，剪一小口，用滴管注入5～6ml不完全培养液(严禁刺破肠管)。

   3) 反复冲洗，将冲洗液吸入15ml离心管，1000rpm5min离心，用完全培养液混悬，调整细胞密度。

2. SP2/0骨髓瘤细胞的制备

   1) 选取状态良好、处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞。

   2) 弃去原瓶中培养上清，用不完全培养液冲洗三遍。

   3) 再以不完全培养液对细胞进行充分吹打，得到的细胞悬液移入15ml离心管。

   4) 细胞计数。

3. 脾细胞的制备

   1) 3天前加强免疫的小鼠，摘眼球取血后，拉颈处死，75％酒精浸泡3～5min。

   2) 将小鼠固定于泡沫板上，打开腹腔，取出脾脏，用不完全培养液反复冲洗。

   3) 在平皿中的网筛中，用镊子夹取脾脏进行反复研磨，边磨边滴加不完全培养液，直到脾细胞单个化，将细胞悬液转入15ml离心管中。

   4) 细胞计数。根据两种细胞计数结果，调整悬液用量，配平之后(SP2/0细胞与脾细胞数量比值在1：5～1：10之间)，以1000rpm5min离心。

   5) 弃上清，每管加入5ml不完全培养液，吹打混匀后合并于同一15ml离心管中，再次以1000rpm5min。

   6) 离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。

4. 细胞融合

   1) 前面步骤所得到的细胞沉淀，轻弹离心管管底，使其呈糊状。

   2) 在37℃水浴中，轻轻振荡，一边缓缓加入1mlPEG，边加边摇，PEG于1min内加完。

   3) 加完PEG之后，将悬液在37℃水浴中静置1min。

   4) 继续在37℃水浴中，边摇边加入不完全培养液2ml，于2min内加完。

   5) 慢慢加入不完全培养液，800rpm，8min。

   6) 弃上清，加入含1％HAT、20％FCS的培养液，轻轻混匀。

5. 在96孔细胞培养板中加入饲养细胞上清，1滴/孔；之后加入融合细胞悬液，1滴/孔。

6. 镜下观察96孔板中细胞情况，CO₂孵箱中培养。

7. 实验结果计算

一只小鼠可获得(1～2.5)×10⁸个脾细胞，与(2～3)×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。显微镜下可见单个分散的细胞，细胞培养3～5天后即可出现小克隆，杂交瘤细胞较大，呈圆形且透明，其它细胞透光性差并逐渐死亡。

注意事项

1. 细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:5到1:10不等。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。

2. 培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、胎牛清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。

3. PEG对细胞有毒性作用，所以滴加速度及时间至关重要，时间短影响融合，时间长会造成细胞毒性，日后细胞生长不好。

4. 新融合细胞较脆弱，所有操作过程需轻柔，避免过高速度离心或用力搅拌等。

5. 融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。