新技术可高效诱导单克隆抗体

　　抗体药物作为生物技术产业的关键驱动力，能安全有效地对癌症、自身免疫病和感染性疾病等进行靶向治疗，该药物在2012年创下全球645.7亿美元的销售额，占生物制药51.8%的份额。目前抗体药物的市场需求量仍在攀升，预计到2015年，抗体药物销售额有望达980亿美元左右。业内人士认为，随着疾病谱变化，抗体药物的黄金时代已经来到。

　　单抗药物的作用靶点很重要的一部分是行使细胞功能必不可少的跨膜蛋白，包括多通道膜蛋白MMP(如G蛋白偶联受体)和离子通道，这些蛋白也是诊断检测的重要分析靶点。目前跨膜蛋白占据了40%以上的单抗药物靶点，而成功被单抗药物靶向结合的仅占少数。

　　多数MMP的抗体已用于商业用途，不过其中的绝大多数表现不佳，通常局限在Western blot等研究领域。而一些MMP的单克隆抗体在活细胞经流式细胞仪筛选和功能分析时具有用处，然而在制备过程中生成量少且难度和成本都很高。

　　膜蛋白功能受其三维结构支配，对于抗体而言，要想对细胞的生理效应施加影响必须结合在膜蛋白上，事实上膜蛋白中仅有胞外片段才适合抗体结合。从结构上看，由不连续片段(或环状结构)构成的MMP胞外区域，是多段经细胞膜分隔的多肽序列，其复杂的三维结构在缺乏膜的情况下无法形成。

　　X射线晶体学研究表明，抗体结合位点(CDR)的“足迹”是一段面积约20X30埃的区域构成，图一示意鼠源单抗药物ADORA2A的结合位点和胞外区域的相对大小。ADORA2A足迹具有56个氨基酸构成的胞外面积，这足以接触G蛋白偶联受体的整个胞外片段(GPCR胞外的多肽片段处于50至 125个氨基酸之间)。

　　高性能抗体

　　为了研制针对MMP胞外片段的高性能抗体，研究人员必需对动物进行免疫接种并收集一些能识别膜蛋白结构(作为抗原足以接触抗体同时具有高亲和性)的抗体。值得注意的是，短的线性多肽抗原不能折叠成自然3维结构因而不能作为膜蛋白胞外区域的重要部分，此外，提纯的完整膜蛋白即便包括完整的胞外区域也不能用于功能抗体的研发，因为其在缺少膜的支持下不能折叠成天然结构。

　　研究人员经常利用病毒样颗粒(VLPs)和转染细胞(表达特定的靶标分子)研制出 MMP抗体，但是这一方法面临的问题是，其它非靶标蛋白的存在使得特定抗体分子的生成量极其低。为了改变可用抗体不足以及制造成本高的现状，SDIX公司研制出新方法可生产针对MMP胞外区域的高性能抗体。

　　DNA免疫操作是新方法的核心，其诱导的抗体免疫要明显强于VLP或转染细胞诱导的。经研究，DNA免疫能够在免疫动物细胞膜上合成高纯度的MMP靶定分子，尤为重要的是，新表达的蛋白在其它外源分子没有干扰的条件下刺激免疫系统高效地合成抗体。此外，由于MMP分子在哺乳动物细胞中表达，可绕开提纯或蛋白失活等问题，这对于高度脆性和易失活的MMP分子而言是极其重要的。从技术流程上看，免疫接种后利用融合技术获取杂交瘤细胞，并利用流式细胞仪高通量筛选那些表达MMP靶标分子的细胞。

　　单一抗原的多个抗体表位

　　为了验证DNA免疫技术的有效性，研究人员研制出3种MMP分子(GPCRs CXCR4，ADORA2A和 CD20)的单克隆抗体。值得肯定的是，这项技术诱导出针对单一MMP分子的大量单克隆抗体(它们具有独特的结合位点和潜在功能)，从杂交瘤细胞中分别筛选出93种CXCR4单抗、15种ADORA2A单抗以及51种CD20单抗。

　　对抗体基因序列的分析得出，抗体高度多样化地应对3种MMP分子。93种CXCR4单抗中有75种有独特序列，而15种ADORA2A单抗和51种CD20单抗中有独特序列的分别是14和34种。

　　那些表达MMP突变基因的细胞经表位图谱分析后也表现出多样性。目前已知的CXCR4单抗主要结合在胞外的第二圆环，但是来自DNA免疫动物的CXCR4表现出8种不同的结合模式;同样地，大多数现有的CD20单抗可分为2大类(利妥昔单抗样和ofatumumab样)，而来自DNA免疫动物的CD20单抗表现出9种已知的和未知的特点。DNA免疫过程中温和的抗原递呈方式可解释表位模型的多样化，而新发现的表位可能在传统的蛋白免疫过程中被破坏掉。

　　来自DNA免疫动物的单克隆抗体可与现有的单抗药物想媲美。在流式细胞试验中，SDIX公司研制的单克隆抗体表现出高亲和性和反应独特性，其研制的所有 ADORA2A单抗在流式细胞试验中反应强烈，而CXCR4和CD20的多种单克隆抗体要比现有基准抗体具有更高的亲和性。