SARS早期检测N蛋白阳性率最高，新冠呢？

　　今天看到2005年1月一篇文章，这篇文章的核心结论是：

　　针对SARS，对疑似患者血清标本进行N蛋白的检测 , 比鉴定抗体更有意义，而且阳性率高。

　　如下图，发病后1-5天，检测N蛋白是阳性率最高的方法。

　　我想向各位专家请教的问题是：

　　1、这个结论可靠吗？

　　2、对于COVID-19的病人，检测新冠的N蛋白也会有这种效果么？

　　之所以想探究这个问题，原因是：

　　我们拿到了结合新冠N蛋白的核酸适配体（类似抗体），适配体可以用来开发N蛋白的检测方法，如果这个结论在新冠状病毒感染中也成立。我愿意免费开放我们的技术和适配体信息。

　　以下是原文的全文，连接见这里。

　　《四种试剂盒在SARS实验室早期诊断中的作用分析》

　　高阳 周端华 吴新伟 陈小霜 狄飚 刘于飞 陈芳 杜琳 徐慧芳 顾菁 郑伯健 徐建国

　　广州市疾病预防控制中心 ,510080

　　摘 要：目的比较 4 种检测严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS CoV) 基因、抗原和抗体的试剂盒在SARS患者早期实验室诊断的可能作用。方法

　　用 3 种酶联免疫吸附试验 (ELISA) 分别检测SARS CoVIgG、SARS CoVIgM 和SARS CoVN蛋白 , 用荧光定量聚合酶链反应 (F PCR) 检测SARS CoV核酸。

　　结果：根据 162份血清的检测结果 , 发病 1-5 天 , N抗原的阳性率可达 90.2% (55 /61) ；发病后的第 15-18 天IgG和IgM阳性率为92.8% (13/14) ；根据 82 份咽拭子的检测结果 , F PCR法在发病后1-5天的阳性率可达 5 6 .3% (14 / 2 4 ) , 6-9 天可达 71.4 % (10/14 ) 。

　　结论

　　除了检测SARS CoV病毒基因的F PCR方法以外,对疑似患者血清标本进行N蛋白的检测 , 具有早期预报意义。

　　关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒； 阳性率；

　　收稿日期：2004-09-16

　　基金： 广东省科技厅资助项目 (2 0 0 3FD0 2 0 4)；

《The effects of 4 laboratory test kits in early detecting of severe acute respiratory syndrome coronavirus》

　　Abstract：Objective To compare the 4 test kits on severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) gene, antigen and antibody for early diagnose of SARS patients. Methods Three enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kits were used to detect SARS-CoV IgG, IgM and N protein and fluorescent polymerase chain reaction (F-PCR) kit was used to detect SARS-CoV RNA. Results In 162 serum samples, 90.2% (55/61) became N protein positive in 1-5 days and 92.8% (13/14) became positive IgM and IgG in 15-18 days after the onset of disease, respectively. On 82 gorgling samples, the positive rates of F-PCR were 56.3% (14/24) in 1-5 days and 71.4% (10/14) in 6-9 days after the onset. Conclusion Other than F-PCR, N protein had good effect in the early detection on dubious patients which could lead to effective prevention and control of the epidemic.

　　Keyword：Severe acute respiratory syndrome coronavirus； Positive rates；

　　Received： 2004-09-16

　　早发现、早诊断、早隔离是有效控制严重急性呼吸综合征 (SARS) 爆发或流行的关键。但是, 一些早期病例的临床症状往往不典型, 难以和常见的非典型肺炎鉴别。仅仅依靠临床症状可延误诊断, 错失有效控制疫情的最佳时机。因此, 早期诊断往往依赖于实验室检测结果。目前, 可以发挥早期诊断作用的主要检测方法有SARS冠状病毒 (SARS-CoV) 核酸检测 (RT-PCR) [1]、病毒特异性抗原检测 (酶联免疫吸附试验, ELISA) 和抗体的检测[2,3]。SARS-CoV特异性抗体检测方法包括ELISA、间接免疫荧光法 (IFA) 和免疫印迹法 (WB) 。我们采用国内常用的几种检测病毒基因、抗原和抗体的方法, 对收集到的SARS患者的血清标本和漱口液标本进行比较检测, 结果报道如下。

　　材料与方法

　　1.标本:

　　血清标本包括162份SARS患者血清和73份健康人血清标本。SARS患者血清来源于2003年2-4月广州市住院患者, 其恢复期血清 (发病后3-5月) 抗体中和试验均阳性 (中和试验结果由香港大学提供) 。采血时间最早为发病后第1天, 最晚为发病后第59天。还包括广州2003年12月至2004年1月确诊为SARS的4例患者的血清标本。漱口液标本82份, 2003年2-4月采自广州市各级医院的SARS患者, 采样时间最早为发病后第1天, 最晚为发病后第45天。

　　2.检测方法:

　　采用第一军医大学珠江医院开发的检测N (nucleocapsid) 蛋白的试剂盒和北京华大吉比爱公司发展的检测IgM和IgG抗体的试剂盒[4], 以及达安基因公司的检测SARS-CoV基因荧光定量PCR试剂盒[5]。均按厂家提供的说明书严格操作。第一军医大学珠江医院开发的ELISA方法, 是用基因工程表达的SARS-CoV N蛋白, 制备单克隆抗兔抗体, 包被微孔板, 以辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的双抗体夹心ELISA法。北京华大吉比爱的ELISA方法, 是用纯化的SARS-CoV裂解液为抗原包被微孔板, 为间接ELISA法。达安基因公司的荧光定量PCR试剂盒是以SARS-CoV的pol基因1b区的一个保守区为靶基因, 扩增片段长度为85 bp, 设计特异性引物及荧光探针, 利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA, 再将cDNA进行PCR扩增, 利用全自动荧光PCR检测仪在线检测荧光信号, 用于漱口液等标本中的SARS-CoV核酸。

　　结果

　　1.特异性抗原、抗体检测结果:

　　采用3种ELISA试剂盒检测162例SARS患者血清标本的结果见表1。

表13种ELISA试剂盒检测162例SARS患者 血清的结果

　　珠江医院研制生产的检测N抗原的试剂盒在发病后第1-5天检测阳性率90.2%, 6-9天为76.0%, 10天以后检测阳性率明显下降 (χ2=7.41, P=0.01) 。北京华大吉比爱公司的检测IgM和IgG抗体的ELISA试剂盒在发病后的第15-18天检测率达92.8%。以后随着发病后天数的增加, IgM抗体阳性率下降 (χ2=4.40, P=0.04) , IgG抗体阳性率不变 (χ2=0.01, P=0.93) 。73份健康者血清的N蛋白和IgM和IgG抗体的检测结果均为阴性。

　　横向比较不同检测方法在发病后同一时间的检测阳性情况发现, 感染后1-5天N抗原的阳性率最高 (χ2=175.17, P<0.01) , 6-9天仍为N抗原的阳性率最高 (χ2=26.39, P<0.01) , 发病后10-14天, IgM抗体和IgG抗体的阳性率高于N抗原 (χ2=6.51, P=0.04) , 发病后15-18天IgM和IgG抗体的阳性率仍然高于N抗原 (χ2=29.87, P<0.01) , 发病后19天以上者, IgG抗体的阳性率最高 (χ2=67.52, P<0.01) 。

　　2.核酸检测结果:

　　采用荧光定量PCR法检测82例SARS患者漱口液标本结果见表2。采用达安基因公司研制的荧光定量PCR试剂盒, 发病后第1-5天检测阳性率56.3% (14/24) , 6-9天为71.4% (10/14) , 10-14天为63.6% (14/22) , 15天以后检测阳性率明显下降。

表2 荧光定量PCR试剂盒检测70份SARS患者 漱口液的结果 下载原表

图1为发病后的不同时间4种检测方法的灵敏度曲线变化。4种试剂盒在SARS发病后不同时间的检出阳性率

　　3. 2003年末以后新发4例SARS病例检测结果:对2003年12月至2004年1月在广州发现的4例SARS患者的血清和漱口液标本采用上述4种方法的检测结果见表3。

表3 2003-2004年广州4例SARS患者的检测结果 下载原表

　　讨论

　　本研究所选择血清标本来源于162例SARS患者, 其临床症状均符合卫生部颁发的《传染性非典型肺炎临床诊断标准 (试行) 》, 其相应的恢复期血清均经抗体中和试验检测为阳性, 为确诊的SARS病例。所选择的咽拭子标本来自于上述患者。

　　研究发现, 对于早期诊断来说, 在发病后1-5天采取患者血样标本, 使用检测N蛋白的试剂盒进行检测, 阳性率可达90.2%。采取咽拭子、肛拭子等标本进行病毒基因的检测, 使用荧光定量PCR阳性率则为56.3% (14/24) [6,7]。检测IgM和IgG抗体的ELISA等试剂盒尽管在实践中表现出一定价值, 但是由于SARS-CoV侵入机体、感染靶细胞、产生抗体需要一定的时间, 在发病1-6天基本上检测不到针对N蛋白的特异性抗体[8,9,10]。因此从理论上讲, 检测N蛋白同时合并SARS-CoV基因检测的方法, 可获得更早的有诊断意义的数据。检测N蛋白的试剂阳性率比较高的原因, 可能是因为N蛋白为SARS-CoV的主要蛋白, 合成的量大, 在病程早期以可溶性抗原的形式释放到患者血液中[4]。

　　对2003年末广州新发4例SARS患者血清和漱口液的检测结果, 提供了进一步的资料。从检测结果来看, N蛋白仍然表现出很好的早期诊断价值。但由于2003年末发病的患者临床表现不典型, 症状轻, 预后好, 没有发现传播的证据, 而S基因的序列资料分析结果表明, 导致2003年末感染的SARS-CoV是动物源性的, 和2003年上半年人间流行的SARS-CoV有很大的区别, 因此两者之间表现出的差异, 可能是因为病毒株的不同造成的[11,12]。

　　虽然我们选择的患者均经过临床诊断和血清中和试验的确诊, 但是血清标本和患者的相对应关系, 及与咽拭子标本之间的相对应关系不清。尽管2003年疫情的特殊情况给分析结果带来了遗憾, 但仍然提供了非常有价值的参考数据[13]。我们的研究认为, 除了检测SARS-CoV基因的PCR方法以外, 对疑似患者血清标本进行N蛋白的检测, 具有早期预报意义, 虽然还不能够明确诊断, 但是可提醒我们及时采取有效的预防和控制措施, 防止疫情的扩散, 并密切注视患者的抗体变化, 及时明确诊断。

　　附：关于新冠核酸适配体的相关问题回答

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