Science大型低成本，外显子测序成果

　　来自华盛顿大学医学院，霍德华休斯医学院等处的研究人员利用一种新型技术，完成了多达2446个样品外显子测序分析，找到了自闭症谱系障碍(ASD，Autism Spectrum Disorder)的多个频发突变，不仅为治疗ASD疾病提供了新思路，而且也提出了一种低成本，多基因测序新方法。相关成果公布在Science杂志上。

　　领导这一研究的是华盛顿大学医学院Jay Shendure副教授，以及Evan E. Eichler教授，第一作者为Brian O"Roak，这一研究组致力于自闭症的分子机理研究。

　　自闭症谱系障碍(ASD，Autism Spectrum Disorder)是根据典型自闭症的核心症状进行扩展定义的广泛意义上的自闭症，既包括了典型自闭症，也包括了不典型自闭症，又包括了阿斯伯格综合症、自闭症边缘、自闭症疑似等症状。

　　让人担心的是，目前此类疾病的患病概率很高――据相关报告显示：平均每88个儿童中就有一个儿童患病。几十年来，科学家们一直在讨论遗传与环境因素对自闭症的影响，而关于基因成分与自闭症关系的讨论却是近几年才开始的。

　　之前的三个研究组，包括Eichler教授研究组在内发现了引起儿童大脑变异从而导致其社交问题的上百种，甚至上千种基因突变，但是要在大规模样品基础上，进行精确的重测序，寻找致病基因依然不容易，而且成本高。

　　在最新这篇文章中，研究人员改进了分子倒置探针(Molecular Inversion Probe，MIP)技术，从而研发出了一种新型多重靶向测序方法，这种方法成本低，精确度高，是基因测序技术的又一新发展。

　　分子倒置探针技术与线性探针序列相比，能够指数级减少由于线性引物序列所引起的交叉反应及二聚体现象，具备了分子挂锁探针的优点。这种探针由7部分序列组成：2个内切酶识别位点，可利用限制性内切酶处理探针序列，2段目的基因互补序列，以及2段通用引物序列以及1段特异性标签序列。

　　利用这种技术，研究人员对两千多位受到不同类型ASD影响的患者进行了多基因分析，完成了四十四种基因的测序，在其中十六种基因中发现了27种随机突变。并且研究人员发现了6种频发突变：CHD8，DYRK1A，GRIN2B，TBR1，PTEN和TBL1XR，这些基因高频发生突变，可能是造成 1%偶发性的自闭症谱系障碍的病因。

　　这项研究结果揭示了自闭症谱系障碍的分子病理机制，并提出了一种低成本，多基因测序新方法，这种方法可以用于可能是由随机破坏性的突变风险造成疾病的遗传分析。

　　外显子组测序的机遇与挑战

　　2009年，基因组定向捕获工具的出现，让外显子组的捕获成为可能。科学家们普遍认为外显子组测序比全基因组测序更有优势，特别是对罕见的单基因疾病。不仅仅是费用更低，数据的阐释也更为简单。因此，外显子组测序去年也被Science杂志评为年度十大突破。

　　Jay Shendure副教授曾对此发表过一篇综述性文章，评述了这一领域发展的机遇和挑战：他认为，外显子组测序未能解决相当大比例的孟德尔表型，即使是在遗传结构已清楚的模式生物中。如果我们希望解决所有的孟德尔遗传病，那么了解这些失败的基础将是至关重要的。同时，人们很想了解稀有变异对常见病的作用。许多研究都从外显子组测序开始，但是仍在进行中，因为需要大量的样本，才具有说服力。

　　外显子组测序鉴定出大约2万个变异，而全基因组测序鉴定出400万个变异。尽管蛋白改变的变异与其他变异的分离优先被证明是有用的，但无疑也是粗略的。从外显子组转移到基因组，为了未知的信号增加，我们要承担100倍的噪音增加。因此，我们需要更精密的方法，为编码和非编码变异分配更加适当的“先验值”。

　　不过尽管如此，Shendure也依然认为外显子组测序代表了“高产的遗传学”，通过较少样本的外显子组测序和适中的投资，就可以明确鉴定新的疾病基因。随着分析成本的进一步降低和分析精密度的提高，这种模式的生产力也会提高。

　　基因组水平的DNA甲基化研究新方法

　　Jay Shendure与其研究组今年还发表了另外一篇方法技术的原创性成果，报道了一种新的亚硫酸氢盐测序方法。

　　全基因组亚硫酸氢盐测序带来了高分辨率且全面的甲基化模式检测，但它需要大量的起始材料。在构建文库时，通常需要5μg以上的基因组DNA。因此，对于起始材料有限的样本，这种甲基化分析方法不适用。

　　相比之下，低代表性的亚硫酸氢盐测序需要的起始DNA要少一些，但同时牺牲了全面性。与分析整个基因组不同，这种方法聚焦于基因组的特定区域。而对于癌症和发育等领域的研究人员来说，起始材料往往有限，这也就限制了分析方法的选择。

　　而Shendure的方法方法仅需1ng起始DNA，但仍然能提供全基因组DNA甲基化模式的全面分析。其秘诀在于文库构建方法，这种称为 “tagmentation”的方法比连接法更高效。基于tagmentation的全基因组亚硫酸氢盐测序方法利用Tn5转座子将DNA片段化，并同时掺入接头。与连接方法相比，转座子方法更加高效，也减少了所需的DNA起始量。

　　这种方法为样品量有限的表观遗传学研究人员提供了一个新选择，比如癌症的甲基化研究。此外，研究人员也在进一步优化方法，尝试使用更少的样品量。