分子生物学常用实验技术（十二）
第九章分子杂交技术 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick 碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA 分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA 或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。探针必须经标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。第一节核酸探针标记的方法 核酸探针根据核酸的性质，......阅读全文
分子生物学常用实验技术（十二）
第九章分子杂交技术 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick 碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA 分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总D
分子生物学常用实验技术（十八）
五、操作步骤：（一）、模板制备1、M13 单链模板制备：在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG 的培养基上铺板之后, 含有M13 重组子的细胞将表现出无色的"噬菌斑"，事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死，出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的
分子生物学常用实验技术（七）
（四） 电泳分析 通常合成的cDNA 第一链和第二链长度为350-6000 碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的9-12 步，一般第一链和第二链上样量相同。1. 标准分子量DNA 参照物的同位素标记(1) 通常
分子生物学常用实验技术（十三）
2. 从RNA 合成单链cDNA 探针cDNA 单链探针主要用来分离cDNA 文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA 探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT 为引物合成cDNA 探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列
分子生物学常用实验技术（九）
第三节从动物组织提取基因组DNA一、材料 哺乳动物新鲜组织。二、设备 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。三、试剂1、分离缓冲液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶K (20mg/
分子生物学常用实验技术（十七）
第二节T7 DN A 聚合酶测序技术一、概述 T7 DNA 聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA 聚合酶用适当方法处理后，可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA 聚合酶又称T7
分子生物学常用实验技术（十六）
（三）电泳：1、预电泳（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE 缓冲液。（3）稀释10×TBE 缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳
分子生物学常用实验技术（一）
第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定第二章DNA 酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章RNA 的提取和cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组DNA 的提取第七章RFLP 和RAPD 技术第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测
分子生物学常用实验技术（十五）
第十章测序技术 在分子生物学研究中，DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger 等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam 和Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随
分子生物学常用实验技术（十四）
三、菌落原位杂交 对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。1、材料：待检测的细菌平皿，已标记好的探针
分子生物学常用实验技术（十）
第二节RFLP 技术一、材料 基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。二、设备 电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4 块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸，eppendorf 管(0.5ml)若干。三、试剂：1、限制性内切酶(BamHⅠ, Ec
分子生物学常用实验技术（三）
第二章DNA 酶切及凝胶电泳第一节概述一. DNA 的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结
分子生物学常用实验技术（十一）
第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节概述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA 的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火
分子生物学常用实验技术（五）
第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第一节概述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA 的第一链和第二链,将双链cDNA 和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA 文库,构建的cDNA 文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA 和相
分子生物学常用实验技术（二）
第三节操作步骤 一、细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。 二、质粒D
分子生物学常用实验技术（八）
第五章重组质粒的连接、转化及筛选第一节概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA 片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得
分子生物学常用实验技术（六）
一、材料 提纯TMV 病毒液（10mg/ml）。二、设备 冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂 TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 缓冲液，无RNA 酶的双菌水。四、操作步骤1、取一eppendorf 管加入提纯
分子生物学常用实验技术（四）
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外
分子生物学常用实验技术（page－1)
第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定 第二章DNA 酶切及凝胶电泳 第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第五章重组质粒的连接、转化及筛选 第六章基因组DNA 的提取 第七章RFLP 和RAPD 技术 第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第九章分
分子生物学常用实验技术（page－3)
分子杂交技术 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick 碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA 分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DN
分子生物学常用实验技术（page－2)
一、RNA 制备 模板mRNA 的质量直接影响到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的结构特点,容易受RNA 酶的攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA 酶,人
常用的分子生物学基本技术
核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的
分子生物学实验常用试剂配置
一. 常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammon
分子生物学实验常用试剂配置
常用贮液与溶液1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。10mol/L乙酸胺（ammonium ac
分子生物学实验常用试剂配置
一. 常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammo
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍
核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍！
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍！ 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定
生物化学与分子生物学最常用的实验技术
分子细胞生物学研究所用的实验技术有哪些分子诊断学的研究范畴包括：利用遗传学、病理学、免疫学、生物化学、基因组学、蛋白质组学和分子生物学的理论和方法探讨疾病发生和发展的分子机制。为整个疾病过程寻求特异的分子诊断指标，以及利用分子生物学技术为这些分子诊断指标建立临床实用的检测方法。细胞培养技术指的是细胞
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍！
核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成
常用的分子生物学基本技术2
IS PCR的技术特点 （1）既具有PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA；（3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4）可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定