蛋白质的短暂表达实验

实验材料 载体

试剂、试剂盒 牛血清DMEM葡聚糖PBSDMSOEDTA

仪器、耗材 培养皿培养箱相差显微镜离心机

实验步骤

1.  将目的基因亚克隆至合适的载体中得到所需的重组DNA，用小量法（5 ml 培养物）或用CsCl/溴化乙锭离心法纯化重组DNA。

2.  将在DMEM-10 CS中生长汇片的COS-7细胞（每100 mm 培养皿约细胞）在转染的前一天以1：5的比例分瓶，这样第二天细胞将长至约50%汇片的程度，让细胞在 CO2培养箱中于37℃生长过夜至约50%汇片。

3.  使用前（相应于待转染的每一个100 mm 平皿的COS细胞）将55 ml 37℃的DMEM-10 NS 培养液与5~10 μg 重组DNA彻底混匀，再加入0.2 ml 葡聚糖/氯喹溶液，混匀。
 
4.  吸出COS细胞的培养液，向每一个100 mm 平血加入步骤3制备的DMEM-10 CS/DEAE-葡聚糖/DNA。在CO2培养箱中，37℃温育细胞3~4 h（可能需要优化），用相差显微镜观察细胞。
 
5.  吸出DMEM/DEAE-葡聚糖/DNA，加入5 ml 10%DMSO（用PBS配制），室温温育细胞2 min。吸出DMSO并加入10 ml DMEM-10 CS。让细胞在培养箱中于37℃ 生长过夜（12~20 h）。

6.  将毎个100 mm 平皿中转染的COS细胞传代至两个新的100 mm 平血。按步骤7a或 7b于37℃温育细胞。

7a.  当表达分泌蛋白时，在完成步骤6后96 h，加入5 ml DMEM-10CS并培养4天。收获培养液，室温下以约1 000 g 离心10 min，除去死细胞和碎片，保留上清液，用代谢标记、免疫沉淀、免疫亲和层折、放射免疫、免疫印迹或生物学鉴定来检测分泌蛋白质。

7b.  当表达细胞表面蛋白或细胞内蛋白时，按步骤5转染后72 h，从细胞中吸出培养液。加 入5 ml PBS，摇晃洗涤，吸出PBS。加入5 ml 溶于PBS中的0.5 mmol/l EDTA，在COS培养箱中37℃保温15 min。用巴斯德吸管轻轻移出培养皿中的细胞，采用合适的 荧光抗体使细胞表面蛋白染色，通过显微镜或流式细胞仪检测。