QPCR常见问题及其分析
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中,有下面几点需要注意: 1. MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。 2. 更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。 3. 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样! 4.......阅读全文
QPCR常见问题及其分析
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400
QPCR常见问题及其分析
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为10
QPCR常见问题及其分析
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓
QPCR常见问题及其分析
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400
qPCR常见问题及其分析解决方法
常见问题 1. 无Ct值出现 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂
同科生物qPCR常见问题及分析
通常来讲,real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80~150 bp之间,所以只需要变性和退火就可以了。 SYBR@Green等染料法,zui好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物
同科生物qPCR常见问题及分析
通常来讲,real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80~150 bp之间,所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法,zui好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序
测序常见问题及其分析
1、PCR 产物测序时出现重叠峰 问题图1(模板中有碱基缺失,往往是单一位点(1-1)或两个位点(1-2)碱基缺失导致测序 结果移码) 解决方法:将PCR 产物克隆到质粒(如T 载体)中挑单克隆测序,或将PCR 产物进行PAGE 纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进
测序常见问题及其分析
1、PCR 产物测序时出现重叠峰 问题图1(模板中有碱基缺失,往往是单一位点(1-1)或两个位点(1-2)碱基缺失导致测序 结果移码) 解决方法:将PCR 产物克隆到质粒(如T 载体)中挑单克隆测序,或将PCR 产物进行PAGE 纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进
测序常见问题及其分析
1、PCR 产物测序时出现重叠峰问题图1(模板中有碱基缺失,往往是单一位点(1-1)或两个位点(1-2)碱基缺失导致测序结果移码)解决方法:将PCR 产物克隆到质粒(如T 载体)中挑单克隆测序,或将PCR 产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序。问题图2(PCR 产物不纯,