全长cDNA文库的构建—SMART技术
真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。 常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息......阅读全文
全长cDNA文库的构建—SMART技术
真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利
RACE技术扩增构建全长cDNA文库
实验概要利用RACE(利用PCR技术快速扩增全长mRNA)技术构建全长cDNA文库是传统C库构建技术的改进。本实验即是利用寡核苷酸帽法，进行全长C库的构建，从而掌握RACE技术的原理与基本操作方法。实验原理其原理是利用真核mRNA的3’poly(A)和5’帽子结构作为标签，用通用引物识别并配对标签序
cDNA文库构建
cDNA文库构建可以：（1）用于分离全长基因进而开展基因功能研究；（2）筛选目的基因并直接用于表达；（3）提供构建分子标记连锁图谱的所用探针。实验方法原理cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建
cDNA文库构建
实验方法原理 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基
cDNA文库构建
cDNA文库构建 实验方法原理 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
cDNA文库构建
cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制
cDNA－文库的构建
此经典方案建立在 Gubler-Hoffman 法（Gulber-Hoffman 1983) 之上，分为六个阶段。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）上册，作者：黄培堂。实验材料λ噬菌体臂大肠杆菌菌株用于λ噬菌体的包装抽提物试剂、试剂盒放线菌素 D二硫苏糖醇EDTATris-ClMgCl2反转录酶
cDNA－文库的构建
实验材料 λ噬菌体臂 大肠杆菌菌株 用于λ噬菌体的包装抽提物 试剂、试剂盒 放线菌素 D
cDNA文库构建技术cDNA链的反转合成
构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组,基因克隆的重要方法,而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA，在这个逆转录过程中，模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mRNA来讲，一
cDNA文库构建技术cDNA链的反转合成
实验概要构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组，基因克隆的重要方法，而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA，在这个逆转录过程中，模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mR
cDNA－文库的构建2
阶段 3:cDNA 的甲基化 材料 缓冲液和溶液 将贮存液稀释到合适浓度。 氯仿 10XEcoRⅠ 缓冲液 1XEcoRⅠ 甲基化酶缓冲液（选用) 如希望，可替代步骤 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。 EDTA(0.5mol/L,pH8.0) 乙醇 MgCl2(
cDNA文库的构建3
接头-衔接子与cDNA的连接8.将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中：10×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 2μl800~1000 ng 的磷酸化接头或衔接子 2μlT4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml） 1μl10 mmol/L ATP 2μl混匀后，在16℃温育8~12h。9
cDNA文库的构建2
10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和 cDNA分开。11. 加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量
cDNA文库的构建1
分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 [阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链] 1.在置于冰上的无菌微
cDNA－文库的构建3
阶段 5:SepharseCL-4B 凝胶过滤法分离 cDNA材料缓冲液和溶液乙醇乙酸钠（3 ml/L,pH5.2)TE(pH7.6)含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)凝胶琼脂糖凝胶（1%)见步骤 8。核酸和寡核苷酸cDNA阶段 4 中步
cDNA－文库的构建（三）
阶段 3:cDNA 的甲基化材料缓冲液和溶液将贮存液稀释到合适浓度。氯仿10XEcoRⅠ 缓冲液1XEcoRⅠ 甲基化酶缓冲液（选用)如希望，可替代步骤 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。EDTA(0.5mol/L,pH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)NaCl(5mol/L)
cDNA－文库的构建（一）
实验材料 λ噬菌体臂大肠杆菌菌株用于λ噬菌体的包装抽提物试剂、试剂盒 放线菌素 D二硫苏糖醇EDTATris-ClMgCl2反转录酶RNase 抑制剂用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物poly(A)+RNA[a-32P]dCTPEDTA乙醇(NH4)2SO4β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸T4
cDNA－文库的构建（四）
方法cDNA 末端的削平1.cDNA样品（来自步骤 11)于 68°C 加热5 min。这一步骤是使cDNA分子的单链突出端可能形成的双链结构发生变性。2. 将cDNA溶液冷却至37°C并加入下列试剂：5xT4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液
cDNA－文库的构建（二）
7. 尽可能快地进行 cDNA 合成的下一步骤阶段 2:cDNA 第二链的合成材料缓冲液和溶液将贮存液稀释到合适浓度。氯仿EDTA(0.5mol/LpH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)(NH4)2SO4(1mol/L)将 1.3 g 固体硫酸铵溶解于终体积为 10 ml 的水中，溶液经滤膜过滤
cDNA文库的构建和筛选
材料许多生物是疾病研究或探索使细胞和机体应对和存活于不同刺激下的分子适应机制的优良模型。 cDNA 文库的构建和随后目的基因的筛选可促使研究者发现在调节和响应某些外部特定环境压力中有重要作用，而在其他体系中可能不表达或者不存在的新基因。确定这些新基因的可读框，进一步分析其编码蛋白质的功能可以开创全新
构建cDNA文库的层析柱cDNA分级
这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般4
cDNA文库构建的注意事项
构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RN
构建cDNA文库的注意事项
噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的
基因组文库和cDNA文库的构建及筛选
刘芝华 中国医学科学院肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室 概念： 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；cDNA文库是指含有所有重组cDNA的克隆群体。 基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上
构建cDNA文库的反转录的注意事项
这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的m
SMART技术简介
真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3’末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5’端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA
SMART技术
真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3’末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5’端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cD
CDNA文库
CDNA文库（主要内容如下）· Construction of cDNA Library· Construction of Genome DNA Library· Library Screening OthersConstruction of cD
各家cDNA文库构建试剂盒优缺点比较
Invitrogen的:采用的是Gateway技术：利用λ噬菌体位点特异重组系统的BP和LR双向反应，首先将PCR产物用传统方法克隆到Gateway化的入门载体，这个目标基因就可以迅速方便而且定向地重组到任何Gateway化的表达载体上.优点:1无需限制酶切、无需连接，只要利用重组酶就可以穿梭于任何
CDNA文库筛选
CDNA文库筛选（一）λgt11 cDNA文库铺平板宿主细菌制备1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。2．将过夜培养物以3000×g离心5min。3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L