RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
第一节 概 述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。 一、RNA制备 模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提......阅读全文
RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
第一节 概 述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加
互补DNA的合成步骤
1．cDNA第一链的合成所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应，主要有两个关键因素，一个是mRNA模板，另一个是反转录酶 [3] 。商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒
互补DNA的合成步骤
1．cDNA第一链的合成所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应，主要有两个关键因素，一个是mRNA模板，另一个是反转录酶 [3] 。商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒
互补脱氧核糖核酸的合成步骤
1．cDNA第一链的合成所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应，主要有两个关键因素，一个是mRNA模板，另一个是反转录酶 [3] 。商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒
分子生物学常用实验技术（五）
第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第一节概述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA 的第一链和第二链,将双链cDNA 和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA 文库,构建的cDNA 文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA 和相
cDNA第二链的合成方法
cDNA第二链的合成方法有以下几种：（1）自身引导法。合成的单链eDNA3’端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物。当第一链合成反应产物的DNA—RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段或反转录酶合成eDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，
互补DNA第二链的合成方法介绍
（1）自身引导法。合成的单链eDNA3’端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物。当第一链合成反应产物的DNA—RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段或反转录酶合成eDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步克隆。但自身引导合成法
关于cDNA第二链的合成方法介绍
（1）自身引导法。合成的单链eDNA3’端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物。当第一链合成反应产物的DNA—RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段或反转录酶合成eDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法
求教cDNA制备的一般方法
一、制备用于克隆cDNA的mRNA1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法2.磁珠法分离mRNA注意：一般需要做mRNA完整性的检测（检查mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力、mRNA分子的大小等）；如果用于制备cDNA文库则还需要检测mRNA在细胞中的丰度。二、
引导大脑发育的“垃圾DNA”
荧光染料追踪的lncRNA 引导大脑发育的“垃圾DNA” 近日，加州大学旧金山分校(University of California, San Francisco)的研究人员发现，曾被当做是“垃圾”的一种特异性DNA在大脑发育中发挥了重要的作用，并有可能与几种毁灭性的神经系统疾病相关
EDTA容量法
方法提要在pH5～6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，以二甲酚橙为指示剂，用EDTA标准溶液滴定。锰、铁、铝和铅等干扰元素，可在硝酸-氯酸钾分解试样后加硫酸铵、氟化钾、乙醇和氢氧化铵沉淀分离。铜的存在，干扰测定，可在滴定前加硫氰酸钾和硫代硫酸钠使铜沉淀为硫氰化亚铜以消除其影响。本法适用于1%以上锌的测定。试
MEDTA－的特点
1. EDTA具有广泛的配位性能，几乎能与所有的金属离子形成稳定的螯合物 有利之处：提供了广泛测定元素的可能性（优于酸碱、沉淀法） 不利之处：多种组分之间易干扰——选择性 2. EDTA与形成的M -EDTA 配位比绝大多数为1:1 3. 螯合物大多数带电荷，故能溶于水，反应迅速
mRNA提取、分离纯化
从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之
DNA－印迹法的技术特点
中文名称DNA 印迹法英文名称Southern blotting定 义DNA经酶切和凝胶电泳分离后转移至尼龙膜或硝酸纤维素薄膜上，用探针进行杂交后分析目的DNA片段的方法。应用学科细胞生物学（一级学科），细胞生物学技术（二级学科）
置换色谱的技术特点
置换色谱(displacement chromatography) 作为一种非线性色谱技术， 是指样品输入色谱柱后， 用一种与固定相作用力极强的置换剂(disp lacer) 通入色谱柱， 去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进， 使样品中各组分按作用力强弱的次序， 形成
分子实验方法4:RNA的提取和cDNA合成
第一节 概 述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工
双链DNA探针随机引物合成法
随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切
置换色谱法的技术介绍
样品加载到色谱柱上后，用含有一种比样品组分保留作用更强的化合物(顶替剂或置换剂)的流动相洗脱，而将样品组分置换流出色谱柱的分析方法。
DNA结合分析法的功能特点
中文名称DNA结合分析英文名称DNA-binding assay定 义一种研究DNA结合蛋白与其DNA靶序列相互作用的方法。将蛋白质与标记的DNA片段在一定条件下作用，进行非变性凝胶电泳，可以检测到DNA与蛋白质结合后电泳迁移率降低的条带。应用学科生物化学与分子生物学（一级学科），方法与技术（二级
缬氨酸的化学合成法及特点
化学合成法的特点是生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物。用异丁醛作原料，有多种方法可合成外消旋体缬氨酸。例如异丁醛与氨生成氨基异丁醇，再与氰化氢合成氨基异丁腈，然后水解得到缬氨酸，外消旋体的拆分也有多种方法，例如用酰基-DL-氨基酸的酶进行水解，再利用游离氨基酸与酰化体的溶解度差进行分离。微
关于凝血机制的概术
人体受物理损伤后，血小板会受到损伤部位激活因素的刺激，出现血小板的聚集，成为血小板凝块，起到初级止血作用。 接着血小板又经过复杂的变化产生凝血酶，使邻近血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白，互相交织的纤维蛋白使血小板凝块与血细胞缠结成血凝块，即血栓（见凝血因子）。同时血小板的突起伸入纤维蛋白网内，血
乙二胺四乙酸（EDTA）及其螯合物
一. EDTA的离解平衡 在水溶液中，2个羧基 H+转移到氨基N上，形成双极离子： EDTA 常用 H4Y 表示，由于其在水及酸中的溶解度很小，常用的为其二钠盐：Na2H2Y·2H2O ，也简写为EDTA 。 当溶液的酸度很高时，两个羧基可再接受H+ ，形成H
实用电子显微镜技术
第一章 电子显微镜技术发展简史第一节 电子显微镜发展简史一、国外电子显微镜生产简况二、国内电子显微镜生产简况三、电子显微镜的发展第二节 电子显微镜技术的发展与应用一、电子显微镜技术的发展二、电子显微镜技术的应用第三节 其他显微技术的发展第四节 电子显微学主要学术组织和刊物一、国内电子显微学学术组织及
克隆化酵母DNA的操作实验——基因置换技术
实验材料酵母实验步骤一、整合性破坏1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。2. 在此内部片段中将质粒线性化。3. 继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。二、基因破坏一步法1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。2. 采用合适的限制性位点，从步骤1
浅述农药残留速测仪的五大性能特点
近年来，随着人们生活水平的提高，人们对健康的意识越来越增强，而农药残留的问题是我们生活中时时常常发生的，与我们生活如此贴近，别以为它很远，其实它就在我们的身边，所以我们要提高警惕，对于蔬菜、水果我们要使用农药残留速测仪对它们进行检测，如果发现农药残留过多，我们要下定决心弃之。这里说到了农药残留速测仪
什么是置换色谱法？
置换色谱(displacement chromatography) 作为一种非线性色谱技术， 是指样品输入色谱柱后， 用一种与固定相作用力极强的置换剂(disp lacer) 通入色谱柱， 去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进， 使样品中各组分按作用力强弱的次序， 形成
随机引物合成法双链DNA探针标记法
随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活
合生物活性玻璃引导牙周组织再生的X射线能谱分析
目的现有研究分别证实了应用胶原膜,生物活性玻璃倍骼生治疗骨缺损的有效性和优越性,本实验欲通过建立重度牙槽骨水平缺损模型,植入可吸收性胶原膜和/或生物活性玻璃倍骼生,观察其对牙槽骨和牙周附着的再生作用。方法于3只beagle 犬的前磨牙区域,运用人工去骨及正畸结扎丝结扎法建立重度牙槽骨水平缺损模型,分
密度天平的原理:浮力法和置换法
浮力法与置换法：根据阿基米得的原理测定一个物质的密度，说明固体浸没在液体中的重量、体积和密度之间的关系。但测定密度要地测定样品的体积是困难的。当物体完全地被浸没在液体时，要求物体的体积与置换液体的体积是相等的。因而我们可以获得密度和液体重量和固体重量之间的关系。许多简单和的测定重量方法可以排除需要测
Science及Nature共述：口袋里的DNA测序仪，可实时诊断
纳米孔测序的想法起始于25年前， 2012年5月4日《Science》首次报道了Oxford Nanopore公司研制的纳米孔测序仪样机——MinION，用于破译病毒DNA。然而MinION的发展历程并不那么顺利，英国牛津大学基因组学中心基因组学家Rory Bowden说，“众所周知，在每次读取