克隆化酵母DNA的操作实验——基因置换技术
实验材料酵母实验步骤一、整合性破坏1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。2. 在此内部片段中将质粒线性化。3. 继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。二、基因破坏一步法1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。2. 采用合适的限制性位点，从步骤1抅建的质粒中切出含有被破坏基因的片段，凝胶电泳纯化。用1~10 μg 凝胶纯化片段进行转化并选择插入标记。 3. Southern 杂交法确证破坏结果。如果转化二倍体，产生孢子后经剖分以获得带有被破坏基因的单倍体孢子。三、转移1. 将目的基因亚克隆到YIp5，诱变质粒或者引入确定的缺失或插入突变。 2. 从质粒的线性化开始，按整合性转化方案进行（基本方案1）。 3. 将转化子在非选择性液体培养基（YPD或含尿......阅读全文
克隆化酵母DNA的操作实验——基因置换技术
实验材料酵母实验步骤一、整合性破坏1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。2. 在此内部片段中将质粒线性化。3. 继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。二、基因破坏一步法1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。2. 采用合适的限制性位点，从步骤1
克隆化酵母DNA的操作实验
实验材料 酵母实验步骤 将待研究的基因亚克隆到YIP质粒。2. 用限制性内切酶在克隆化基因内部切开，使质粒线性化。3. 用1~10 μg DNA加上担体DNA转化适合的菌株，通过质粒上带的标记进行选择，在选择培养基上纯化几个转化子，制备DNA，应用Southern 杂交确证整合是否发生在所期
克隆化酵母DNA的操作实验——穿梭质粒
实验材料酵母实验步骤1. 构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株，及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。2. 将必需基因亚克隆到YCp载体（带有URA3以外的选择标志），取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。3. 转化至步骤1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省却成分平
克隆化酵母DNA的操作实验——质粒缺口修复
实验材料酵母实验步骤1. 将目的基因亚克隆到YRp质粒，通过基因内的两个限制性位点在基因中创造一个缺口区，在缺口两侧留下≥100~250 bp 的同源区，凝胶电泳纯化质粒骨架大片段。 2. 用1~10 μg 缺口质粒DNA转化待拯救的含突变等位基因的酵母菌株，通过YRp质粒上的选择基因进行选择，
克隆化酵母DNA的操作实验——整合性转化
实验材料酵母实验步骤1. 将待研究的基因亚克隆到YIP质粒。 2. 用限制性内切酶在克隆化基因内部切开，使质粒线性化。 3. 用1~10 μg DNA加上担体DNA转化适合的菌株，通过质粒上带的标记进行选择，在选择培养基上纯化几个转化子，制备DNA，应用Southern 杂交确证整合是否发生在
基因置换实验
—步基因破坏法 两步基因置换法 质粒改组 构建融合蛋白 实验材料 酵母菌株7-1 BY4741
基因置换实验——两步基因置换法
实验步骤
酵母菌基因组DNA的提取实验
基本方案 实验材料 酵母菌 试剂、试剂盒
酵母菌基因组DNA的提取实验
实验材料 酵母菌试剂、试剂盒 SE缓冲液山梨醇EDTA溶菌酶PVP蛋白酶K缓冲液 Tris仪器、耗材 高速冷冻离心机台式离心机恒温水浴低温冰箱冷冻真空干燥器取液器电泳仪水平电泳槽紫外观测仪实验步骤 1. 1.5 ml 对数生长期细菌细胞。2. 离心，12 000 rpm，1-2 min。3.
基因置换实验——质粒改组
实验材料酵母菌株7-2 2404质粒pDB141pRG68试剂、试剂盒诱变的pDB141 DNA仪器、耗材YPD 平板HC-leu平板5-FOA平板实验步骤第 1 天将菌株 7-2 在 YPD 平板上划线，30°C 培养。第 3 天挑一个丰满的菌株 7_2 菌落，接种到 5 mlYPD 培养液，30
基因置换实验———步基因破坏法
基因置换是酵母研究中最有效和最重要的技术之一。这种技术能使一个在染色体正常位置的基因与其离体条件下构建的等位基因进行置换，使置换前后的菌株仅仅在这个特殊的等位基因上存在遗传差异。利用这种方法可以分析在基因克隆中由无效突变 (null mutationr) 或其他任何类型突变所引起的表型变化。无论在理
酵母实验操作方案（2)
附录一 培养基 LB： Tryptone 10g 1% Yeast Extract 5g 0.5% NaCl 5g 0.5% 【Agar】 15g 1.5%（固体培养基另加） dH2O稀释至1L，高压灭菌 YPD： Yeast Extract 10g 1%
酵母实验操作方案（1)
一．质粒酶切及线性化1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。2）线性化质粒使用80μl酶切体系9KSF2质粒 70μl内切酶（SacI， SalI， BglⅡ） 2μl10 x buffer 8μl3）酶切3－16小时，一般3小时即
基因置换实验——构建融合蛋白
实验材料菌株BY4741质粒PDB118试剂、试剂盒磷酸盐缓冲液仪器、耗材YPD 平板YPD 液体培养基血球计数板SC-his平板实验步骤YPD 平板 第 1 天将菌株 7-3 在 YPD 平板上划单克隆，30°C 下培养两天。第 3 天挑取单克隆，在 5 mlYPD 液体培养基中培养，30°C 过
酵母菌基因组DNA的提取实验——基本方案
实验材料酵母菌试剂、试剂盒SE缓冲液山梨醇EDTA溶菌酶PVP蛋白酶K缓冲液Tris仪器、耗材高速冷冻离心机台式离心机恒温水浴低温冰箱冷冻真空干燥器取液器电泳仪水平电泳槽紫外观测仪实验步骤1. 1.5 ml 对数生长期细菌细胞。2. 离心，12 000 rpm，1-2 min。3. 沉淀。4
酵母菌DNA制备实验1
实验材料酵母试剂、试剂盒YPD破菌缓冲液酚氯仿异戊醇LB仪器、耗材玻璃珠试管摇床培养箱离心机实验步骤1. 注盛于一个13 mm×100 mm 无菌玻璃试管中的2 ml 培养基接种含有带目的基因的质粒的酵母单菌落，在转动或摇动培养箱中30℃过夜培养到静止期。 2. 将1.5 ml 的过夜培养物转移
酵母菌DNA制备实验2
实验材料酵母试剂、试剂盒TERNA酶乙酸铵无水乙醇仪器、耗材离心机培养箱玻璃培养管实验步骤1. 在18 mm×150 mm 无菌玻璃培养管或17 mm×100 mm 无菌聚丙烯酰胺管中用10 ml YPD培养基过夜培养酵母菌至静止期。2. 培养物室温下在台式离心机上1 200 g 离心5 min
将DNA导入酵母细胞实验
乙酸锂转化 电穿孔转化 单链高分子质量载体DNA的制备 实验方法原理 实验材料
将DNA导入酵母细胞实验
实验方法原理 实验材料 待转化的酵母菌株试剂、试剂盒 YPD培养基YPAD培养基：添加30 mg L腺嘌呤半硫酸的YPD培养基高纯无菌水l0×TE缓冲液pH 7.5无菌10×乙酸锂储液：1 mol L乙酸锂pH 7.5 (用稀乙酸调pH)过滤除菌DNA ：高分子质量单链载体DNA和待转化DN
分子克隆化载体DNA的选择介绍
①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以
分子克隆化DNA片段的制备介绍
常用以下方法获得DNA片段： ①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段； ②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段； ③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段； ④从mRNA反转录产生cDNA。
克隆化基因的体外转录和翻译实验
DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。实验材料DNA试剂、试剂盒TE核苷三磷酸混合液RNA聚合酶缓冲液异丁醇NaOHTCA仪
克隆化基因的体外转录和翻译实验
实验材料 DNA试剂、试剂盒 TE核苷三磷酸混合液RNA聚合酶缓冲液异丁醇NaOHTCA仪器、耗材 离心机摇床实验步骤 1. 亚克隆编码蛋白质的目的DNA片段于质粒载体的SP6或T7启动子的下游。 2. 通过CsCl/溴化乙锭离心或PEG沉淀制备质粒DNA。 3. 用位点在终止密码子的立即下游
克隆化基因的体外转录和翻译实验
基本方案 实验材料 DNA 试剂、试剂盒
酵母菌基因克隆实验
实验材料 酵母菌实验步骤 1. 用含LEU 2作为选择标志的酵母菌DNA文库转化lea 2 cdc 101-1酵母菌株，在23℃培养，依据插入片段的大小，筛选2 000~20 000个Leu+转化体。 2. 影印平板转化体，将其转印到预热的选择性平板，并于37℃培养筛选互补温感突变的表型。过
酵母基因组DNA的玻珠制备法
实验概要本实验利用玻珠制备法制备了酵母基因组DNA。主要试剂无菌水，裂解缓冲液，5mol/L NaCl，苯酚，氯仿：已戊醇(24：1)，乙醇，TE缓冲液，EDTA-Sark，蛋白酶K，5mol/L醋酸铵主要设备摇床，玻璃离心管，台式离心机，玻珠，振荡器，P-1000移液器，1.5ml离心管实验步骤1
人肌肉基因首次插入面包酵母DNA
荷兰研究人员成功将人类肌肉基因插入面包酵母的DNA中，这是科学家首次将如此重要的人类特征植入酵母细胞，得到的人源化酵母模型，可作为药物筛选和癌症研究工具。相关论文发表于《细胞报告》杂志。 代尔夫特理工大学研究团队添加到酵母细胞中的特征由一组十个基因控制，人类没有这些基因就无法生存。这组基因包含了
酵母基因组DNA简易高效提取方案
1. 10ml菌液过夜培养至饱和（OD600值为2-3） 2. 离心沉降细胞（Sorvall中以2000rpm的速度），然后以冷的、等体积的无菌蒸馏水洗涤 3. 将细胞沉淀在200μl 裂解缓冲液中重悬浮，然后加入约300μl 玻璃珠和200μl的1：1苯酚：氯仿混和液 4. 漩涡摇匀1-2min
克隆化基因体外合成蛋白质分析DNA蛋白质相互作用实验
体外合成的蛋白质对于测定一个克隆的基因是否编码一个特异的DNA结合蛋白， 以及分析DNA-蛋白质相互作用都是极为有用的。为了检测DNA的结合能力，可将标 记的蛋白质与特异的DNA片段共温育，用非变性丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质-DNA复 合物与游离的蛋白质分离开来。来源：《精编分子生物学实验指南》第五版
细胞型操作实验——用两步基因置换法进行交配型转换
实验材料酵母菌株YSC006YSC005质粒pSC9pSC11仪器、耗材YPD 平板SC-ura平板产孢平板无菌绒垫SD 平板实验步骤第 1 天把菌株 9-4 和 9-5 在 YPD 平板上划单克隆，于 30°C 下培养。1、2、3、4 组使用菌株 9-4;5、6、7、8 组使用菌株 9-5。第 3