Pichia酵母表达系统操作方法
我先说我有的质粒和菌株：PPIC9K，PPIC9，PPICZahphaA，B，C以及一个改造的PPIC9K载体，EcoRI和BamHI双酶切，C末端引入了一个6histag菌株：GS115，KM71，X33，以及十几个空载体对照菌株我的酵母表达Protocol：>10ug质粒用Sal线性化，加1/10体积的3M NaAC PH5.2和3倍体积的乙醇沉淀70％乙醇洗一遍，20ul ddH2O重溶按照公司手册做电转化感受态，一般OD600到1.1-1.3，0.2cm转化杯中电转化每个样品涂5块左右10cm的MD板，一般有>1000个转化子足够用不同浓度的G418板筛选，一般做0.5,1.0,2.0mg/ml梯度或干脆用1.0然后每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱......阅读全文
Pichia酵母表达系统操作方法
我先说我有的质粒和菌株：PPIC9K，PPIC9，PPICZahphaA，B，C以及一个改造的PPIC9K载体，EcoRI和BamHI双酶切，C末端引入了一个6histag菌株：GS115，KM71，X33，以及十几个空载体对照菌株我的酵母表达Protocol：>10ug质粒用Sal线性化，加1/1
原位双膜法快速检测Pichia酵母系统阳性表达株
1） 将醋酸纤维素薄膜置于MD/His -平板的His + 转化子菌落上,用涂布棒轻压使醋酸纤维素薄膜完全湿润并赶尽气泡, 使所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上.2) 在BMMY板上置一同样大小的硝酸纤维素薄膜, 并将醋酸纤维素薄膜菌落向上置于硝酸纤维素薄膜上. 30 ℃孵育18 h 后, 将醋酸纤维素
毕赤酵母表达（pichia－pastoris－expression－）实验手册（4）
三．主要试验环节的操作3.1 酵母菌株的分离纯化接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。3.
毕赤酵母表达（pichia－pastoris－expression－）实验手册（1）
大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在
Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法
模板的处理：1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；2.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；3.用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在PCR
毕赤酵母表达（pichia－pastoris－expression－）实验手册（3）
液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：yeast extract
毕赤酵母表达（pichia－pastoris－expression－）实验手册（5）
3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法3.5.1 模板的处理：1. 平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；2. 将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非
毕赤酵母表达（pichia－pastoris－expression－）实验手册（2）
一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制1．1 各种母液的配制10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基） 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存 保存期为1年。2
毕赤酵母表达（pichia－pastoris－expression－）实验手册（6）
随着PCR技术的不断发展成熟（扩增长度、保证性、产量和特异性等），质粒构建过程的大多数细胞内的DNA复制将被PCR这一细胞外的DNA复制所代替，质粒构建效率将有质的飞跃。4.4密码子的偏好性的原则酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分
甲醇酵母基因表达系统
1 甲醇酵母表达系统的特点 1.1 宿主 七十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径
毕赤酵母表达系统能在酿酒酵母里表达么
不太可能，Invitrogen的商业化毕赤酵母表达系统属于甲醇酵母表达系统，用的是毕赤酵母独有的AOX1启动子，由甲醇诱导；酿酒酵母用的启动子大多用的是GAPDH或Gal启动子等，由葡萄糖和半乳糖诱导。虽然两种菌株有很多基因具有较高的同源性，但不能通用。建议使用毕赤酵母表达系统，酿酒酵母表达量低，诱
甲醇酵母表达系统的高效表达特性
已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一，但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10～100倍[2]。如表皮生长因子（EGF）在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L，而在甲醇酵母中为4
关于酵母表达系统的概述
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。
CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较
CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生
简述甲醇营养型酵母表达系统
甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统。甲醇酵母主要有汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，并以毕赤酵母属(Pichia)应用最多。 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色
常用的酵母表达系统的介绍
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。 常用的酵母表达系统： 一、酿酒酵母(Saccharomycescerevisi
毕赤酵母表达系统的特点
自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它
关于甲醇酵母表达系统的基本介绍
甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三种，其中Pichia Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛。与以往的基因表达系统相比，
关于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统的介绍
酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面包业的使用已有数千年的历史，被认为是GRAS(generally recognized as safe)生物，不产生毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外
简述甲醇酵母表达系统的应用前景
经过近几年的发展完善，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Ex
甲醇酵母系统表达的影响因素2
2、表达框的染色体整合位点和方式虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。AOX1和组氨酸脱氢酶(hist
甲醇酵母系统表达的影响因素1
酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。
甲醇酵母系统表达的影响因素3
甲醇诱导的方式、用量、诱导时间都会影响外源蛋白的表达水平。在诱导期间每天应往培养基中补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发；但由于培养条件和转化子表型不同，添加甲醇的量也有所不同，一般添加量为培养基体积的0.5％～1％。诱导时间过短则表达量很低，过长则外源蛋白的降解增加，应根据菌株的需要选择合适的诱导时间
关于甲醇酵母表达系统的关键因素—表达载体的介绍
首先，甲醇酵母中没有稳定的质粒，所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶（甲醇代谢的关键酶）基因-1（AOX1）的启动子（PAOX1）和转录终止子（3′AOX1）构建成整合型表达载体。PAOX1是一个极强的启动子，醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%[2]，所以能使外源蛋白质在
酵母表达载体的构建与酵母转化
实验概要本实验介绍了酵母表达载体的构建、酵母转化方法及酵母抗逆实验。主要试剂试剂配制：1 .1 M Tris.Cl(pH 7.5)(100 ml)：12.1g Tris碱，加80 ml ddH2O，浓HCl调pH 7.5，定容至100 ml；2. 0.5 M EDTA(pH 8.0) (100 ml
甲醇酵母表达系统的关键因素—受体菌的介绍
在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，诱导基因表达，使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件，细胞干重达100g/L以上，蛋白质产量极高[14]。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型，从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体
设计出新型酵母表达平台
近日，华东理工大学生物工程学院教授蔡孟浩课题组在新型酵母表达设计方面取得重要进展，开发了可响应用户自定义信号的高效酵母蛋白表达平台。相关成果已在线发表于《科学进展》。高水平、可调控的基因表达，对于生物医药和生物制造产业中的蛋白高效率、高质量生产极为重要。酵母作为人们熟知的一种真核微生物，在食药方面的
重组毕赤酵母的表达
实验概要本文介绍了重组毕赤酵母目的基因表达的方法及条件，为毕赤酵母表达因素给予指导，但对于任何表达系统，最优化条件因表达蛋白的特征而不同。实验步骤1. Mut 胞内或分泌表达：为检测表达条件是否有效，可培养GS115β-gal (Mut )(胞内表达-半乳糖苷酶)。亲代载体转化GS115 或KM71
重组乙型肝炎疫苗甲基营养型酵母的简介
共有4种表达系统。甲基营养型酵母生产HbsAg具有培养基廉价，目的基因与酵母染色整合的优点， 不仅可克服质粒丢失，还可提高表达量。汉逊酵母（Hansenula Polymorpha，H.P.）和毕赤酵母（Pichia Pastoris，P.P.）系统已应用于工业化生产。已上市的酿酒酵母和甲基营养
甲醇酵母表达注意事项1
试验的注意事项1、信号肽识别位点的设计以质粒pPICZαA为例。在利用PCR反应在外源基因两端引入酶切位点的试验中。如果质粒pPICZαA双酶切中丢失了KEX2蛋白酶的酶切位点 Lys－Arg，应该在上游中，增加了编码Lys、Arg的密码子AAA、AGA 。酵母细胞膜中中的KEX2蛋白酶是α