cDNA文库构建的注意事项
构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量......阅读全文
cDNA文库的物化方法
基因工程初始阶段所用的方法，已不用。利用核酸双螺旋之间存在着碱基G C，A T配对特性，分离目的基因。 例如：海胆rDNA分子内其G C含量可以达63%（其稳定性高，溶解温度高），通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA，最后经氯化铯平衡梯度离心，得到相对分子量为1.9X107Dal
关于cDNA文库的简介
cDNA文库（cDNA library）：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA
怎样去除cDNA文库构建过程中的核糖体RNA
反转录结束后，加RNase处理
差减cDNA文库法
差减cDNA文库法[第一条链cDNA合成]1．合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入：10×第一条链合成缓冲液 5.0μl10mM dNTP Mix(1.4μg/μl) 2.5μl(终浓度1.25mM)Linker prime
关于cDNA文库的原理介绍
一、定义 （cDNA Library）某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。 二、原理 经典cDNA文库构建的
cDNA文库的构建和筛选—在外界环境压力条件下，...（二）
8 标记探针的合成9 Northern 印迹（1）10X MOPS 缓冲液： 200 mmol/L MOPS， 50 mmol/L 乙酸納， 10 mmol/L EDT A , pH 7. 0。（2）I. 25% 甲醛变性胶：将 3.75 g 琼脂糖溶于 217 m L 双蒸水中，加 E B 至
cDNA文库的构建和筛选—在外界环境压力条件下，...（一）
cDNA文库的构建和筛选—在外界环境压力条件下，新表达基因的鉴定方法实验实验步骤 一、材料所有化学试剂均为分子生物学级纯度。所用塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头均经高压蒸气灭菌。涉及核酸的操作均需带手套。1.总 RNA提取（1）无 RNase 水。加 I mL 焦 炭 酸 二 乙 酯（DEP
差减cDNA文库法1
[第一条链cDNA合成] 1.合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入： 10×第一条链合成缓冲液5.0μl 10mMdNTPMix(1.4μg/μl)2.5μl(终浓度1.25mM) Linkerprimer(1.4μl，终浓度100μg/μl) DEP
差减cDNA文库法3
[大量制备生产单链噬菌体DNA]1.新鲜过夜培养的宿主菌XLI-Blue，以1：20稀释在LB培养液中，在37℃培养扩增2小时。2.加1ml含单链cDNA的上清液。3.再于37℃继续培养2小时。4.然后将全部溶液转到500~1000mlLB中，生长5~6小时。5.9500rpm离心60分钟，除去细菌
差减cDNA文库法2
[cDNA末端磷酸化]1.70℃灭活反应后，稍微离心一下，置室温5分钟。2.在反应混合物（10μl）中加入：1μl10×连接缓冲液2μl10mMATP1μl（10μ）DNA激酶 [限制性内切酶消化]以得到粘性末端 1.限制性内切酶消化DNA和载体。 2.在37℃保温1~5小时，然后冷却到
cDNA文库组标准流程2
(二)动物组织totalRNA的提取 1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。 2．将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。 3．根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0）
cDNA文库组标准流程6
2．pBlueScriptII的双酶切消化 1．以如下体系进行EcoRI酶切： pBSK(+) X µl（6µg） ddH2O 174-X µl 10×Buffer E 20 µl 混匀，加入限制性内切酶： EcoRI （10U/ µl） 6 µl 总体积为200 µl。 2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹
cDNA文库组标准流程4
三．cDNA双链合成1.SupersciptII —RT合成第一链:1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入xul mRNA(大约500ng)1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTT
cDNA文库组标准流程5
4EcoRIadaptor加接:1.往双链 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;2.溶解完成后,顺序加入下列试剂:1.2ul 10×Ligase Buffer1ul 10mMrATP1ul T4DNA Ligase(4U
cDNA文库组标准流程7
2．检测：（PCR方法）取适量PCR薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上待 PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder半小时后照相，观察胶图：insert、vector
cDNA文库组标准流程1
一.Total RNA的提取 (一) 试剂配制 准备工作： 1.研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml /100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2.50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料
cDNA文库组标准流程3
二.mRNA的分离 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 准备工作： 1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解 Oligotex.,然后置于室温。 2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。 3.将
差减－cDNA－文库的建立实验
基本方案 实验方法原理 实验材料 ［＋］ 和 ［-］cDNA 文库（ATCC 或 Stra
cDNA文库分离基因的相关介绍
如果手中有足够量可产生抗体的来源于真核细胞的蛋白质，可以通过双抗体免疫法分离出此蛋白的基因。 基本原理： 核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体，而具有不同长度的新生肽链在核糖体上不断延伸。 将从细胞匀浆液中制备出的多聚核糖核蛋白体同特定抗体一起保温，形成多聚核糖体同抗体的复
差减－cDNA－文库的建立实验
实验方法原理 实验材料 ［＋］ 和 ［-］cDNA 文库（ATCC 或 Stratagene）试剂、试剂盒 TE 缓冲液EcoRI EDTA蔗糖溶液琼脂糖凝胶TBE 缓冲液乙醇S1 核酸酶S1 核酸酶缓冲液苯酚 氯仿 异丙醇乙酸钠AluIRsaI去离子甲醜胺SDS酵母 tRNA氯仿 异丙醇磷
差减－cDNA－文库的建立实验
差减文库包含了存在于一种细胞或组织而不存在于另一种细胞或组织的 mRNA cDNA 克隆。这个 cDNA 文库被用来分离相应于一类 mRNA 的一组 cDNA 克隆，或用 于分离一个特定mRNA 的 cDNA 克隆。这中间筛选 cDNA 克隆的过程是很费劳力的。来源：《精编分子生物学实验指南（第五版
cDNA文库组标准流程八:pBlueScript－cDNA库扩增
1．试剂及配方：2 x LB （1升）： 20g 氯化钠 20g 蛋白提取物 10g 酵母提取物 加入蒸馏水至1升，用NaOH调pH值至7.0，高压灭菌2 x LB－甘油（12.5%）（200ml）175ml 2 x LB液体2
cDNA文库组标准流程三:cDNA双链合成
1. Superscipt II—RT合成第一链:1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入 xul mRNA(大约500ng) 1ul Xho I Primer(1.4ug/ul) (5’ GAGAGAGAGAGAGAG
BAC/PAC－文库的构建
BAC (Bacterial Artificial Chromosome，细菌人工染色体)文库可用于：（1）全基因组测序；（2）构建物理图谱、染色体步查；（3）基因筛选；（4）基因图位克隆。实验方法原理BAC是一种装载DNA大片段的克隆载体系统，用于人、动物和植物基因组文库构建。BAC具有插入片段较
BAC/PAC－文库的构建
BAC文库的构建 实验方法原理 BAC是一种装载DNA大片段的克隆载体系统，用于人、动物和植物基因组文库构建。BAC具有插入片段较大(几千个碱基至350kb)
关于cDNA文库的筛选鉴定的介绍
1．核酸杂交 是最常用，最可靠的方法之一，可大规模地分析文库的克隆子。 1．同源探针：至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列，常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆。 2．部分同源探针：探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同，常用于克隆家族基因。 3．总cDNA
cDNA文库注意获得起始RNA的介绍
构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量
cDNA文库组标准流程五:cDNA双链和载体的连接
1.连接：根据载体和cDNA的电泳定量结果，每个样品设置3个比例的连接，即：insert/vector=1/3 incert/vector=1/1 insert/vector=3/1按以下体系依次加入： ddH2O xulT4 ligase
DNA文库的构建及其筛选
实验材料 DNA试剂、试剂盒 升汞MS培养基琼脂糖EcoR IHind IIIBamH IBg lII Pst I仪器、耗材 电泳仪尼龙膜实验步骤 1.水稻 DNA 的提取水稻 DNA 的提取参照 Dellaporta, Wood 和 Hicks (1983) 法分离总基因组DNA并略有修改。 通过
DNA文库的构建及其筛选
实验方法原理 高等植物基因组的一个显著特征是其内含有大量的 DNA 重复序列, 重复序列常位于异染色质区, 因此可能与染色体的结构有关 . 季静等根据国际上 对基因组、染色体、结构蛋白的研究前沿, 提出染色体 DNA 平均每隔 30 kb